Le glutathion (GSH), ou γ-glutamyl-L-cystéine-glycine, est un acide aminé comprenant trois acides aminés (glutamate, cystéine et glycine) dans la glutamylcystéine synthétase et la glutathion synthétase.
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Le GSH est un tripeptide thiol non protéique synthétisé sous action continue [1], qui joue un rôle important dans la protection des cellules contre les dommages causés par les antioxydants et dans le maintien de l'homéostasie intracellulaire [2-4].Le GSH est largement utilisé dans des domaines industriels tels que l'alimentation [5-7], les cosmétiques [8] et les produits pharmaceutiques [9-12], et il peut être utilisé comme antioxydant et agent aromatique, ce qui permet de prévenir efficacement le brunissement des aliments et de préserver leur saveur unique [13-16], et il peut être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui permet de protéger les reins et d'améliorer la désintoxication du foie [17-18].Le GSH peut également être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui permet de protéger les reins et d'améliorer la désintoxication du foie [17-18]. Le GSH peut également être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui peut protéger les reins et améliorer la capacité de détoxification du foie [17-18].
La fermentation microbienne est actuellement la méthode la plus courante pour la production industrielle de GSH [19-20], mais comme il s'agit d'un produit intracellulaire, la productivité et les avantages économiques de l'extraction du GSH en aval de la fermentation ne peuvent pas répondre efficacement à la demande du marché, ce qui limite le développement de son industrialisation dans une certaine mesure. Si le GSH intracellulaire des souches de fermentation peut être efficacement sécrété dans l'extracellulaire, le GSH purifié peut être préparé directement dans le bouillon de fermentation, ce qui simplifie le processus d'extraction et réduit la difficulté de l'isolement et de la purification du GSH en aval, améliorant ainsi la productivité du GSH. Si le GSH intracellulaire peut être efficacement sécrété vers l'extracellulaire, le GSH peut alors être directement préparé et purifié dans le bouillon de fermentation, ce qui simplifie le processus d'extraction et réduit la difficulté de l'isolement et de la purification du GSH en aval, augmentant ainsi la productivité du GSH. Ces dernières années, la question de savoir comment obtenir des souches de fermentation productrices de GSH extracellulaire a attiré l'attention des chercheurs nationaux et étrangers[21] . Par exemple, l'utilisation de la technologie du génie génétique pour améliorer le transport extracellulaire du GSH par les souches de fermentation[22-24] , ou pour améliorer la perméabilité de la membrane cellulaire afin de promouvoir l'exocytose et l'accumulation du glutathion. Cependant, les coûts de modification et les exigences techniques pour la construction de bactéries de fermentation extracellulaire pour l'ingénierie du glutathion sont élevés, et la régulation de la perméabilité de la membrane cellulaire est une méthode de pénétration chimique à base de réactifs organiques [25], qui ne convient pas à la production industrielle compte tenu de l'impact sur l'activité de croissance des souches et sur l'environnement.
La technique traditionnelle de sélection par mutagenèse UV est non seulement simple et rapide pour sélectionner les souches cibles, mais elle garantit également la stabilité génétique des souches mutantes[26] , cependant, seules les souches mutantes produisant du glutathion intracellulaire, mais pas les souches mutantes produisant du glutathion extracellulaire, ont été sélectionnées par mutagenèse UV dans l'étude actuelle[27-29] . Par conséquent, dans la présente étude, nous avons utilisé Saccharmyces cere- visiae GAQ4 comme souche de départ, et sélectionné une souche mutante génétiquement stable avec une production élevée de glutathion extracellulaire par mutagenèse UV, et augmenté la production de GSH extracellulaire en optimisant les conditions de fermentation, afin de fournir une nouvelle référence pour la stratégie de fermentation extracellulaire du GSH et de parvenir à la production industrielle de la fermentation extracellulaire du GSH. Les résultats fourniront une nouvelle référence pour la stratégie de fermentation extracellulaire du GSH et la production industrielle de GSH.
1 Matériel et méthodes
1.1 Matériaux et réactifs
Saccharomyces cerevisiae GAQ4 : fermentation industrielle dans le laboratoire clé du ministère de l'éducation, université de technologie du Hubei, centre d'innovation collaborative de la province du Hubei, laboratoire A610.
Glucose, poudre de levure, peptone, sulfate d'ammonium, dihydrogénophosphate de potassium, sulfate de magnésium anhydre, poudre d'agar, acide phosphorique (tous analytiquement purs) : Sinopharm Chemical Reagent Corporation ; 1-heptanesulfonate de sodium, glutathion (tous analytiquement purs) : Shanghai McLean Biochemistry Technology Co.
1.2 Instruments et équipements
Banc de purification unique SW-CJ-1D : Suzhou Purification Equipment Co., Ltd ; Incubateur biochimique automatique ZSD-12 : Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Co. PH-mètre universel Sartorius (PB-10) : Sartorius (Shanghai) Trading Co., Ltd ; four de séchage électrothermique à température constante : Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co.
1.3 Méthode d'essai
1.3.1 Méthodes de culture
Milieu liquide des semences : glucose 20 g/L, peptone 20 g/L, levure chimique 10 g/L, pH naturel.
Milieu solide des semences : glucose 20 g/L, peptone 20 g/L, bicarbonate de soude 10 g/L, agar 20 g/L, pH naturel.
Milieu de fermentation : glucose 20 g/L, levure 10 g/L, sulfate d'ammonium 8 g/L, dihydrogénophosphate de potassium 3 g/L, sulfate de magnésium 0,15 g/L, pH naturel.
Culture de semences : prendre la suspension bactérienne conservée dans des tubes de glycérol et l'insérer dans le milieu de semences, et l'incuber à 30 ℃ et 180 r/min de vitesse d'agitation.
Culture de fermentation : prendre la sève de semence en période de croissance logarithmique et la placer dans le milieu de fermentation avec un volume d'inoculum de 10 % en volume, et l'incuber à une température de 30 ℃ et à une vitesse de 180 r/min en agitant le flacon.
1.3.2 Mutagenèse aux ultraviolets
Processus de mutagenèse : préchauffer une lampe UV de 15 W pendant 20 minutes. Prendre la suspension bactérienne de semence en période de croissance logarithmique, diluer la suspension au nombre de cellules de 107 CFU/mL~108 CFU/mL, prendre 200 μL de la solution de dilution et l'étaler sur le milieu solide de semence, puis placer immédiatement la plaque de milieu à une distance de 30 cm de la lampe UV pour l'irradiation UV, le temps d'irradiation était de 10, 20, 30, 40, 50 et 60 s, et chaque groupe a été mis en place en 3 parallèles, et le nombre de colonies bactériennes uniques cultivées sur chaque plaque a été compté. Immédiatement après l'irradiation, les plaques ont été placées à l'envers dans un incubateur à 30 ℃ pour éviter la lumière, et le nombre de colonies uniques cultivées sur chaque plaque a été compté. La suspension bactérienne diluée sans irradiation UV a été étalée sur un milieu solide, puis incubée dans le groupe témoin, qui était protégé de la lumière. Calculer la létalité mutagène UV, prendre le temps d'irradiation UV comme coordonnée horizontale et la létalité mutagène UV comme coordonnée verticale, et tracer la courbe de létalité mutagène UV. La formule de calcul de la létalité mutagène est la suivante.
Létalité mutagène/% = (nombre de colonies sur la plaque de contrôle - nombre de colonies sur la plaque mutagénisée)/nombre de colonies sur la plaque de contrôle × 100.
Mutagenèse UV itérative : en utilisant la teneur en GSH extracellulaire de la souche comme indice de sélection, le GAQ4 a été soumis à une mutagenèse UV itérative, c'est-à-dire que les souches mutantes qui répondaient aux indices de sélection obtenus lors de la mutation précédente ont été utilisées comme souches de départ dans la mutation suivante, puis la sélection des mutations a été effectuée à nouveau. Trois groupes parallèles ont été établis pour chaque mutagenèse afin d'obtenir un nombre suffisant de souches mutantes et d'augmenter le taux de mutation positive. Chaque mutagenèse UV doit être comparée à la courbe de létalité de la mutagenèse UV afin de sélectionner la dose mutagène optimale pour chaque génération de souches mutantes.
Test de stabilité génétique : afin de confirmer que les souches cibles obtenues ont une bonne stabilité génétique, les souches cibles sélectionnées ont été passées successivement 8 fois, et la culture de fermentation a été effectuée sur les 1ère, 4ème et 8ème générations, et la teneur en glutathion extracellulaire de la production de fermentation a été mesurée par rapport au contrôle de la souche de départ GAQ4. 1.3.3 Test à sens unique des conditions de fermentation
Un test à sens unique a été réalisé pour étudier les effets de la période de fermentation, du volume de la fiole d'agitation, du pH initial, de la température de fermentation et de la vitesse de rotation de la fiole d'agitation sur la teneur en GSH extracellulaire produite par la fermentation en fiole d'agitation des souches mutantes, en utilisant la teneur en GSH extracellulaire comme indicateur. La température de fermentation était de 26, 30, 34, 38 et 42 ℃, et la vitesse de rotation du ballon d'agitation était de 120, 140, 160, 180 et 200 r/min. Les conditions de fermentation en ballon d'agitation des souches mutantes ont été optimisées, et les conditions optimales de fermentation en ballon d'agitation ont été déterminées en établissant trois parallèles pour chaque facteur et en prenant la valeur moyenne.
1.3.4 Mesure de la biomasse
Un certain volume de suspension bactérienne a été centrifugé à 8000 r/min pendant 5 minutes pour recueillir le corps bactérien humide, et le corps bactérien a été lavé avec de l'eau stérile pendant 3 fois, puis séché dans une étuve à 65 ℃ jusqu'à obtention d'un poids constant, et ensuite pesé pour obtenir le poids sec des cellules, et la biomasse a été calculée par la formule suivante.
Biomasse/(g/L) = poids sec des cellules (g) / volume de la suspension bactérienne (L)
1.3.5 Détermination du glutathion
La teneur en GSH a été déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) [30]. Les conditions chromatographiques étaient les suivantes : la colonne était une Inertsil ODS-SP C18, et les phases mobiles étaient un tampon heptanesulfonate-phosphate de sodium (6,8 g de 1-heptanesulfonate de sodium, 2,2 g de phosphate de potassium, pH 3,0 ajusté avec de l'acide phosphorique, et du méthanol (90:10 tampon phosphate/méthanol, rapport en volume) à un débit de 1,0 mL/min. Les phases mobiles étaient une solution de tampon phosphate-heptanesulfonate de sodium (6,8 g de 1-heptanesulfonate de sodium, 2,2 g de dihydrogénophosphate de potassium, pH 3,0 ajusté avec de l'acide phosphorique, et de l'eau ultrapure ajustée à 1 L) et du méthanol (le rapport en volume entre le tampon phosphate et le méthanol était de 90:10) à un débit de 1,0 mL/min.
Peser 10 mg d'étalon de glutathion, le diluer dans 10 ml d'eau ultrapure, puis le diluer aux concentrations de 200, 400, 600, 800 et 1 000 mg/L. Les zones de pic correspondant aux différentes concentrations de GSH ont été détectées par la méthode CLHP, et la courbe standard a été tracée par la méthode CLHP avec la concentration de GSH comme coordonnée horizontale et la zone de pic comme coordonnée verticale (comme dans la figure 1), et l'équation de régression de la courbe standard était y=18 045x+168 919, R2 =0,999 3. La courbe standard a été tracée avec la concentration de GSH comme coordonnée horizontale et la surface du pic comme coordonnée verticale (figure 1), et l'équation de régression de la courbe standard était y=18 045x+168 919 avec R2 =0,999 3, ce qui a été utilisé pour le calcul de la teneur en GSH.
2 Résultats et analyses
2.1 Résultats de l'élevage par mutagenèse
2.1.1 Teneur en GSH extracellulaire de la souche de départ GAQ4
La teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 était de 7,37 mg/L après une fermentation en fiole agitée pendant 48 h. La teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 a été utilisée comme indicateur de la souche de départ, et la teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 a été comparée à celle du mutant obtenu par mutagénèse.
2.1.2 Résultats du criblage par mutagenèse UV
En utilisant la teneur en GSH extracellulaire comme indice de criblage, la souche de départ GAQ4 a été soumise à une mutagenèse UV itérative selon la méthode décrite au point 1.3.2. Les résultats du premier criblage par mutagenèse UV sont présentés à la figure 2.
Au total, 200 colonies individuelles ont été prélevées après le premier traitement par irradiation UV, et 15 souches mutantes ont été sélectionnées parmi les souches de criblage primaire sur la base de la teneur élevée en glutathion extracellulaire après fermentation (Fig. 2B), parmi lesquelles la teneur en glutathion extracellulaire du mutant UV1-6 était de 13,87 mg/L, soit une augmentation de 88,20 % par rapport à la souche de départ, et a été sélectionnée pour poursuivre le criblage par mutagénèse UV. La souche mutante UV1-6 a été sélectionnée pour poursuivre le criblage par mutagenèse UV.
Le mutant UV1-6 a été utilisé comme souche de départ pour la deuxième mutagenèse UV, et les résultats du criblage de la deuxième mutagenèse UV sont présentés dans la Fig. 3. D'après la Fig. 3A, on peut voir que la souche mutante a montré un taux de létalité de 78,6 % lorsqu'elle a été irradiée aux UV pendant 30 s, ce qui est plus élevé que la mutagenèse précédente à la même dose, de sorte que nous avons encore choisi d'utiliser la même dose d'irradiation aux UV pour le deuxième traitement de mutagenèse UV.
Comme le montre la figure 3B, 14 souches mutantes ayant une teneur en glutathion extracellulaire relativement élevée ont été sélectionnées après le deuxième criblage par mutagenèse UV, parmi lesquelles la souche mutante UV2-2 avait une teneur en glutathion extracellulaire de 16,10 mg/L, soit 118,45 % et 16,08 % de plus que la souche de départ GAQ4 et la souche mutante UV1-6, respectivement.
Le mutant UV2-2 a été soumis à un troisième traitement de mutagenèse UV, et les résultats sont présentés dans la figure 4.
Comme le montre la figure 4A, la létalité de la troisième mutation UV a manifestement augmenté après la même dose mutagène, et la létalité a atteint 69,5 % à 10 s d'irradiation UV, et 81,9 % à 20 s d'irradiation UV, de sorte que 15 s d'irradiation UV ont été choisis comme durée du traitement de la troisième mutation. Après le criblage, 11 mutants présentant une teneur élevée en GSH extracellulaire ont été obtenus. Comme le montre la figure 4B, la teneur en GSH extracellulaire du mutant UV3-10 obtenu par la troisième mutagenèse était de 19,08 mg/L, soit 158,89 %, 37,56 % et 18,51 % de plus que celle de la souche de départ, du mutant UV1-6 et du mutant UV2-2, respectivement. L'analyse ci-dessus a montré que l'effet de mutation positive de la troisième mutagenèse n'était pas aussi évident que celui des deux précédentes, que la teneur en glutathion extracellulaire n'augmentait que pour un petit nombre de mutants examinés et que la teneur de certains mutants était même inférieure à celle d'avant la troisième mutagenèse, et que la létalité de la mutagenèse UV sous la même dose mutagène augmentait progressivement, ce qui dépassait la gamme de létalité de la mutation positive à haute probabilité. Par conséquent, les souches mutantes UV1-6, UV2-2 et UV3-10 obtenues lors du troisième criblage de mutagenèse UV ont été sélectionnées pour le test suivant.
2.1.3 Résultats de la stabilité génétique
Les souches mutantes UV 1-6, UV 2-2 et UV 3-10 obtenues à partir de trois criblages par mutagenèse UV ont été passées successivement huit fois, et les teneurs en glutathion extracellulaire ont été déterminées après la culture de fermentation de la première génération, de la quatrième génération et de la huitième génération, respectivement, et les résultats sont présentés dans le tableau 1.
La teneur en glutathion extracellulaire la plus élevée (18,56 mg/l) a été observée chez UV 3-10 à la 8e génération, et la performance de fermentation d'UV 3-10 dans la production de glutathion extracellulaire était génétiquement stable, de sorte qu'UV 3-10 a été sélectionnée comme souche cible.
2.2 Optimisation des conditions de fermentation
Dans les conditions initiales de fermentation en ballon d'agitation, c'est-à-dire un volume de remplissage de 100 mL/300 mL, un pH initial naturel, une température de fermentation de 30 ℃ et une vitesse de rotation de 180 r/min, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante était de 18,56 mg/L et la biomasse de la souche mutante était de 5,64 g/L. Des expériences d'optimisation à un facteur ont été réalisées pour le cycle de fermentation, le volume de remplissage du ballon d'agitation, le pH initial, la température de fermentation et la vitesse de rotation de la souche mutante, respectivement. Le cycle de fermentation, le volume de remplissage du ballon d'agitation, la valeur pH initiale, la température de fermentation et la vitesse de rotation du ballon d'agitation ont été optimisés par un test d'optimisation à un facteur. Les effets de la période de fermentation sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible UV3-10 sont présentés dans la figure 5.
Comme le montre la figure 5, la teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante a augmenté puis diminué avec l'allongement de la durée de fermentation. La teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante était de 18,97 mg/L à la durée de fermentation de 48 h. La teneur en glutathion extracellulaire a commencé à diminuer avec l'allongement de la durée de fermentation, c'est pourquoi 48 h a été choisi comme durée de fermentation, et d'autres conditions de fermentation ont été optimisées sur cette base.
L'effet du volume de l'agitateur sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 6.
La figure 6 montre que la teneur en glutathion extracellulaire la plus élevée de la souche cible a été obtenue lorsque le volume de liquide du ballon d'agitation était de 75 mL/300 mL, et que lorsque le volume de liquide du ballon d'agitation augmentait progressivement, la teneur en glutathion extracellulaire commençait à diminuer, et que le volume élevé de liquide du ballon d'agitation affectait l'oxygène dissous dans le ballon d'agitation, affectant ainsi la fermentation de la souche cible, de sorte que le volume optimal de liquide du ballon d'agitation de 75 mL/300 mL a été choisi.
Les résultats de l'optimisation du pH initial de l'agitateur mutant sont présentés dans la figure 7.
Lorsque la valeur initiale du pH est passée de 5,0 à 6,0, la teneur en glutathion extracellulaire n'a pas beaucoup changé, mais lorsque la valeur du pH a été portée à 6,5, la teneur en glutathion extracellulaire a augmenté rapidement jusqu'à 36,42 mg/L, puis a commencé à diminuer avec l'augmentation de la valeur du pH, et a atteint la valeur maximale à pH 6,5.
L'effet de la température de fermentation sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 8.
Comme le montre la figure 8, la température de fermentation a eu un effet plus important sur la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible que les autres facteurs, et l'augmentation de la température de fermentation a favorisé la sécrétion de glutathion extracellulaire par la souche mutante[31] . La teneur en glutathion extracellulaire a augmenté avec la température de fermentation et a atteint 40,63 mg/L à 34 ℃, soit 1,68 fois plus qu'à 30 ℃. Lorsque la température de fermentation a été portée à 34 ℃, la teneur en glutathion extracellulaire a atteint 40,63 mg/L, soit 1,68 fois la température de fermentation de 30 ℃. Lorsque la température de fermentation a été portée à 42 ℃, la teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante a atteint 17,15 mg/L, et la biomasse de la souche mutante a chuté au niveau le plus bas, soit 3,16 g/L. Par conséquent, la température de fermentation optimale a été fixée à 34 ℃.
L'effet de la vitesse d'agitation du ballon sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 9.
La quantité d'oxygène dissous dans le ballon à agitation a été affectée par la quantité de liquide chargée dans le ballon et la vitesse de rotation, la force de cisaillement générée par la vitesse de rotation du ballon, le taux de transfert de masse et la quantité de liquide chargée dans le ballon ont eu un effet sur la quantité d'inoculum, l'état de croissance et la synthèse et l'accumulation des produits de fermentation des souches, comme on peut le voir sur la figure 9, la teneur en glutathion extracellulaire était la plus élevée lorsque la vitesse de rotation du ballon à agitation était de 140 r/min, et la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible avant l'optimisation. La teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible avant optimisation.
Après l'optimisation de la fermentation en flacon à agitation, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante a atteint 52,05 mg/L après 48 h de fermentation, soit 2,80 fois plus que la fermentation pré-optimisée, avec un volume de remplissage du flacon à agitation de 75 mL/300 mL, un pH initial de fermentation de 6,5, une température de fermentation de 34 ℃ et une vitesse de rotation de 140 r/min.
3. la discussion et les conclusions
Dans cette étude, la souche mutante UV3-10 a été sélectionnée pour la production de GSH extracellulaire par mutagenèse UV itérative, et sa teneur en GSH extracellulaire était de 18,56 mg/L. Les conditions optimales pour la fermentation en flacon à agitation ont été obtenues par un test à sens unique, qui comprenait une période de fermentation de 48 h, un volume de chargement de 75 mL/300 mL, un pH initial de 6,5, une température de fermentation de 34 ℃, et une vitesse de rotation de 140 r/min. Après l'optimisation, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois plus élevée qu'avant l'optimisation.
Le mécanisme de sécrétion extracellulaire de la souche mutante UV3-10 a été proposé comme suit : la perméabilité cellulaire de la souche mutante a été modifiée après la mutagenèse, c'est-à-dire que l'activité de certaines protéines exportatrices de GSH a été renforcée ou que l'activité de certaines protéines dégradant le GSH a été inhibée après la mutagenèse, de sorte que les substances intracellulaires des cellules de levure ont spécifiquement débordé vers les zones extracellulaires, et l'accumulation extracellulaire de GSH a été générée dans des conditions de fermentation normales. La relation entre les activités des protéines de transport du glutathion et du système de synthétase du GSH des souches mutantes et leur mécanisme de sécrétion extracellulaire peut être étudiée dans des études ultérieures, et la manière de maintenir la stabilité du GSH extracellulaire en aval de la fermentation est également une question à étudier.
La souche mutante UV3-10 peut secréter le GSH synthétisé intracellulaire en extracellulaire, réalisant ainsi l'accumulation effective de GSH extracellulaire, ce qui améliore considérablement la possibilité de préparation industrielle de GSH dans le bouillon de fermentation, et réduit la difficulté de purification et d'isolation par rapport à l'extraction de GSH intracellulaire, économisant ainsi les coûts de production et la consommation d'énergie. En outre, Saccharomyces cerevisiae est une souche de sécurité alimentaire très appréciée des développeurs de produits alimentaires, et les résultats de l'étude sur la production de GSH extracellulaire par fermentation de Saccharomyces cerevisiae ouvrent de nouvelles perspectives et présentent des avantages économiques pour son application dans la transformation, le stockage et la conservation des aliments, ainsi que dans les arômes fonctionnels.
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