Résumé：La lumière ultraviolette et la nitrosoguanidine ont été utilisées pour mutagéniser la souche de départ SIPI-G0619, tandis que trois écrans de résistance, l'éthionine, le chlorure de zinc et le triazole, ont été utilisés comme modèles de criblage, et une souche stable à haut rendement en glutathion, SIPI-Gh435, a finalement été obtenue ; le rendement en glutathion était de 864 mg/L, ce qui est 4,9 fois plus élevé que celui de la souche de départ.
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Le glutathion (1), un tripeptide formé par la condensation de l'acide glutamique, de la cystéine et de la glycine, est un antioxydant majeur dans les organismes vivants et joue un rôle clé dans le maintien d'un environnement redox adéquat[1] . Les groupes sulfhydryles des molécules de glutathion peuvent se lier de manière compétitive aux oxydes, protégeant ainsi les groupes sulfhydryles des protéines fonctionnelles dans les organismes ; ils peuvent également se lier aux ions de métaux lourds, tels que Pb2+ et As3+, pour empêcher la dénaturation des protéines[2] et jouer un rôle détoxifiant. Dans le même temps, il a également des effets anti-radiation et anti-vieillissement [3,4].
Le glutathion peut être produit par extraction, synthèse chimique et fermentation, la fermentation étant la principale méthode de production [5]. Cependant, le niveau de fermentation de la souche 1 en Chine n'est pas assez élevé pour permettre une production industrielle. Il est donc particulièrement important d'obtenir une souche de 1 à haut rendement et de parvenir à l'industrialisation dès que possible. Dans cette étude, nous avons utilisé la lumière ultraviolette et la nitrosoguanidine pour muter la souche de départ SIPI-G0619, et en même temps, nous avons utilisé l'éthionine, le chlorure de zinc et le triazole comme modèles de criblage, et finalement, nous avons obtenu la souche génétiquement stable à haut rendement de 1 SIPI-Gh435, avec une puissance de fermentation de 864 mg/L, qui est 4,9 fois plus élevée que celle de la souche de départ.
1 Instruments et matériel
1.1 Instruments et réactifs
Chromatographe liquide à haute performance modèle 2 9 9 6 (Water s Company) ; centrifugeuse Allegra TM X-22R (rotor F0850) (Beckman coulter).
Éthionine (Sigma) ; tous les autres réactifs étaient des produits domestiques analytiques purs.
1.2 Souche et milieu
Souche de départ : Levure produisant des prions (Candida u til is) SIPI-G0619 (dans notre collection).
Milieu de culture/g-L-1 : extrait de levure 3,0, glucose 20, peptone 15, agar 22 ; pH naturel.
Milieu pour flacons de semences/g-L-1 : glucose 20, extrait de levure 10, peptone 10 ; 20 ml/250 ml ; pH 5,5.
Milieu de fermentation/g - L-1 : glucose 40, extrait de levure 2,0, (NH4)2SO4 12, K2SO4 3,0, MgSO4-7H2O 1,0, MnSO4-H2O 0,01, FeSO4-7H2O 0,01 ; pH 5,5 ; charge 30ml/250ml.
2 Méthodologie et résultats
2.1 Méthodes de culture et de détermination de la teneur
Méthode de culture d'ensemencement : prélever un anneau d'organismes sur la lamelle activée dans le milieu d'ensemencement, et incuber à 30℃ avec oscillation (220r/min) pendant 24h.
Méthode de culture par fermentation : les graines ont été cultivées pendant 24h, et 5% de l'inoculum a été ajouté dans le milieu de fermentation, et cultivé à 30℃ avec oscillation (220r/min) pendant 32h.
Détermination de la teneur : 1 pour le produit intracellulaire. Le bouillon de fermentation a été centrifugé (10000r/min) pendant 4min, et la bactérie résultante a été extraite avec 2% d'acide sulfurique pendant 2h. La teneur en 1 a été déterminée par HPLC [6].
2.2 Méthodes de mutagenèse
Mutagenèse UV : la suspension bactérienne de la souche de départ SIPI-G0619 a été irradiée par une lumière UV (30W, 30cm de distance, 33r/min) pendant un certain temps, puis étalée sur le milieu de la plaque pour calculer le nombre d'organismes viables et le taux de létalité (tableau 1).
Mutagenèse à la nitrosoguanidine (NTG) : dans des conditions aseptiques, ajouter 0,1 ml de 50 mg/ml de NTG dans un tube à centrifuger contenant 5,0 ml de suspension bactérienne, et le placer sur un agitateur à 28℃. Centrifuger (10 000r/min) pendant 10min, et laver les organismes précipités avec une solution saline à 0,85% pendant 3 fois, puis préparer la suspension bactérienne contenant la solution saline, et l'étaler sur le milieu de la plaque pour calculer le nombre d'organismes viables et la létalité (Tableau 1).
Tableau 1 Létalité des souches après irradiation UV et traitement au NTG à différents moments
mutagène | Temps/min | Nombre de bactéries vivantes/pc-ml-1 | Taux de létalité/pour cent |
UV | 0 | 3.0 x 106 |
|
0.25 | 1.6 x 106 | 47 | |
0.5 | 6.0 x 104 | 98 | |
0.75 | 7.0 x 102 | >99 | |
Rôle du GTN | 0 | 6.0 x 106 | — |
30 | 2.5 x 106 | 58 | |
50 | 6.0 x 104 | 99 | |
80 | 4.0 x 102 | >99 |
Sur la base de l'expérience, une durée d'action de 30 secondes a été choisie comme condition de mutagenèse UV et une durée d'action de 50 minutes a été choisie comme condition de mutagenèse NTG.
2.3 Méthodes de dépistage
2.3.1 Létalité des cribles de résistance contre la souche de départ
Ethionine : est un analogue structurel de 1 et peut inhiber en retour la biosynthèse de 1. Lorsque la concentration d'éthionine est augmentée, le taux de mortalité de l'organisme augmente en raison du manque de 1 (tableau 2).
Chlorure de zinc : des concentrations intracellulaires élevées de Zn2+ peuvent déformer et inactiver le centre actif de la glutathion réductase [7], inhibant ainsi la synthèse du glutathion réduit.Zn2+ est un oligo-élément essentiel pour la croissance des levures, et est également un ion métallique lourd, qui peut favoriser la croissance des levures à faible concentration, mais inhiber l'activité de nombreuses enzymes à forte concentration, ce qui entraîne une augmentation du taux de mortalité des levures (tableau 2).
1,2,4-Triazole : selon la littérature [8], les souches mutantes résistantes aux triazoles ont une plus grande capacité de synthèse1 . Cependant, de fortes concentrations de triazole ont eu un effet inhibiteur sur la croissance cellulaire et la mortalité des levures a augmenté avec l'augmentation des concentrations de triazole (tableau 2).
Tableau 2 Léthalité des souches avec différentes concentrations d'éthionine, de chlorure de zinc et de triazole.
écran de résistance | Concentration/mg-ml-1 | 6Bactéries viables/10 -ml-1 | Taux de létalité/pour cent |
l'éthionine (ET), un acide aminé essentiel | 0 | 5.2 | — |
0.06 | 4.3 | 17 | |
0.1 | 3.3 | 37 | |
0.3 | 1.3 | 75 | |
chlorure de zinc | 0 | 5.2 |
|
0.5 | 3.4 | 35 | |
1.0 | 1.8 | 65 | |
2.0 | 0.19 | 96 | |
triazole (chimie) | 0 | 5.2 | — |
0.1 | 4.7 | 9.6 | |
0.5 | 3.9 | 25 | |
1.0 | 0.3 | 42 |
La létalité (taux d'inhibition) du dépistage de la résistance mixte à la souche de départ était de 7,8 % lorsque le mélange contenait 0,1 mg/ml d'éthionine, 1,0 mg/ml de chlorure de zinc et 0,5 mg/ml de triazole ; et de 95 % lorsque le mélange contenait 0,3 mg/ml d'éthionine, 2,0 mg/ml de chlorure de zinc et 1,0 mg/ml de triazole. Lorsque le mélange de dépistage contenait 0,3 mg/ml d'éthionine, 2,0 mg/ml de chlorure de zinc et 1,0 mg/ml de triazole, la létalité (inhibition) de la souche de départ était de 95 %.
2.3.2 Établissement d'un modèle de criblage de souches à haut rendement et criblage
La plupart des souches mutantes sont mortes en raison de l'inhibition de la synthèse 1 lorsqu'elles ont été appliquées à des plaques contenant trois écrans de résistance : éthionine, chlorure de zinc et triazole. Seules les souches mutantes présentant les levées d'inhibition ci-dessus ont pu se développer sur des plaques contenant des concentrations élevées des écrans de résistance, et étaient probablement les souches les plus productives.
2.3.2.1 Criblage par mutagenèse UV
La souche de départ SIPI-G0619 a été irradiée aux UV pendant 30 secondes. La solution bactérienne mutagénisée a été étalée sur une plaque de criblage contenant de l'éthionine 0,1mg/ml, du chlorure de zinc 1,0mg/ml et du triazole 0,5mg/ml, et incubée à 28℃ pendant 2d.
Au total, 620 colonies simples ont été prélevées pour passer la glissière et ont été tamisées par lots. Le pouvoir de fermentation de la souche de départ était de 176,3 mg/L, dont le pouvoir de fermentation était 1,2 fois plus élevé que celui de la souche de départ. Le pouvoir de fermentation était de 176,3 mg/L, dont le pouvoir de fermentation était plus de 1,2 fois supérieur à celui de la souche de départ, ce qui représente plus de 60 %. Au total, 18 souches ont été sélectionnées avec un rendement égal ou supérieur à 2,3 fois celui de la souche de départ. Après le criblage, une souche à haut rendement, SIPI-Gr232, a été obtenue, avec un pouvoir de fermentation de 475 mg/L, qui était 2,7 fois plus élevé que celui de SIPI-G0619. Cette souche a été utilisée comme souche de départ pour l'étape suivante de la mutagenèse NTG.
2.3.2.2 Criblage par mutagenèse des NTG
La souche SIP I -Gr 2 3 2 a été traitée avec du NT G pendant 50 minutes. La solution bactérienne mutagénisée a été étalée sur des plaques de criblage contenant de l'éthionine à 0,3 mg/ml et du chlorure de zinc à 2,0 mg/ml. 3 mg/ml, du chlorure de zinc 2,0 mg/ml et du triazole 1,0 mg/ml.
530 colonies individuelles ont été sélectionnées pour passer la gélose et ont été tamisées par lots. Plus de 45% des souches avaient une efficacité de fermentation supérieure à 1,2 fois celle de SIPI-Gr232. L'efficacité de fermentation de SIPI-Gh435 était de 864mg/L, soit 1,8 fois celle de SIPI-Gr232 et 4,9 fois celle de SIPI-G0619, et l'efficacité de fermentation de SIPI-Gh435 était de 864mg/L, soit 1,8 fois celle de SIPI-Gr232 et 4,9 fois celle de SIPI-G0619.
2.4 Examen de la stabilité de la souche mutante à haut rendement SIPI-Gh435
La capacité de production de SIPI-Gh435 a légèrement diminué de 100% à 94% après 4 générations consécutives, et a diminué à 83% et 72% après F5 et F6. Ceci indique que la souche SIPI-Gh435 est génétiquement stable.
3 Discussion
Dans [9], une souche mutante résistante de 1 a été obtenue par mutagenèse UV et criblage pour la résistance à l'éthionine, avec un rendement de 180 mg/L. Dans [10], une souche à haut rendement de 1 a été obtenue par mutagenèse UV et nitrosoguanidine et criblage pour la résistance à l'éthionine et au triazole, avec un rendement de 339,1 mg/L. Cependant, la méthode d'ajout des trois résistances, à savoir l'éthionine, le chlorure de zinc et le triazole, à la plaque de criblage comme conditions de criblage n'a pas encore été rapportée. L'ajout simultané d'éthionine, de chlorure de zinc et de triazole à la plaque de criblage en tant que condition de criblage n'a pas non plus été signalé. En utilisant ce modèle, un mutant de résistance stable à haut rendement de 1, SIP I - Gh435, a été obtenu, avec un rendement de 864 mg/L, ce qui était beaucoup plus élevé que le rendement de 1 dans le rapport susmentionné.
Références :
[1] Demopoulos HB, Seligman ML, Pharmaceutical preparations of glutathione and methods of administration thereof : US, 6586404 [P]. 2003-07-01.
[2] Grant CM . Rôle des systèmes glutathion/glutaredoxine et thiorédoxine dans la croissance de la levure et la réponse aux conditions de stress [J]. Mol Microbiol, 2001, 39(3) : 533-541.
[3] Cha JY, Park TC, Jeon BS, et al. Optimal fermentation conditions for enhanced glut athi one production by Saccharomyces cerevisiae FF-8[J]. J Microbiol, 2004, 42(1) : 51-55.
[4] Sun Hong-Gang, Lu Yi-Zhen. Métabolisme et application du glutathion [J]. Health Career Education, 2004, 22(10):126.
[5] ZHOU Yuguang, FU Guoping, XIAO Zaijun. Progrès dans la production et l'application du glutathion [J]. Food Industry Science and Technology, 2003, 24(3) : 89-91.
[6] ZHANG Lirong, WANG Zhigang, XIE Qingjiao. Détermination du glutathion réduit pour injection par HPLC [J]. Qilu Pharmaceutical Affairs, 2005, 24(2) : 93-94.
[7] JIA Jianping, QIU Juanping. Sélection et élevage de souches produisant beaucoup de glutathion [J]. Microbiology Circular, 2003, 30(4) : 24-29.
[8] Hamada S, Tanaka H, Sakato K. Procédé de production de glutathion : US, 4582801 [P]. 1986-04-15.
[9] HU Linhua, TAN Tianwei. Sélection de souches de levure à haut rendement en glutathion et étude préliminaire des conditions de culture [J]. Journal of Chemical Engineering in Higher Education, 2005, 19(2) : 273-276.
[10] TONG Qunyi, CHEN Jian, LI Huazhong. Sélection de levures pour une production élevée de glutathion et leurs conditions de culture [J]. Industrial Microbiology, 2002, 32(2) : 13-17.
