Comment détecter le glutathion réduit par voie électrochimique ?

 Le glutathion est présent dans tous les tissus des mammifères à des concentrations allant de 1 à 10 mM. Il s'agit d'un tripeptide lié à un amide γ, composé de cystéine (Cys), de glutamate (Glu) et de glycine (Gly). Le glutathion existe normalement dans l'organisme sous forme de glutathion réduit (GSH) et de sa forme oxydée (L-Glutathion oxydé (GSSG)) (voir la figure 1 pour la structure), qui se transforment l'un en l'autre dans l'organisme et atteignent un équilibre dynamique, maintenant ainsi l'équilibre redox dans l'organisme [1-2]. Les variations de la concentration de GSH sont étroitement liées au développement de certaines maladies dans les organismes et les tissus, et sa concentration peut être utilisée comme indicateur de diverses maladies telles que la leucémie, la maladie d'Alzheimer, le SIDA, le carcinome cellulaire, le diabète et l'athérosclérose[3-5] . C'est pourquoi les chercheurs se sont engagés dans le développement de tests sensibles et sélectifs pour contrôler la dynamique du GSH dans les organismes, afin de comprendre les mécanismes chimiques de la pathogenèse de diverses maladies au niveau moléculaire et de fournir des méthodes et des outils pour le diagnostic clinique et la thérapie ciblée.

 

Jusqu'à présent, les principales méthodes utilisées pour la détermination du glutathion comprennent la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), l'électrophorèse capillaire (EC), l'analyse optique et les méthodes électrochimiques[6-9] . Les méthodes électrochimiques sont utilisées depuis longtemps pour l'analyse du GSH en raison de la simplicité de leur équipement, de leur faible coût, de la miniaturisation et de l'intégration des électrodes, qui peuvent être transformées en dispositifs portables pour les analyses sur site et in vivo. Dans cet article, nous passons en revue les nouvelles avancées dans les méthodes de détection du GSH basées sur des techniques électrochimiques rapportées au cours des dernières décennies, et nous donnons un aperçu des tendances futures de la recherche.

 

1 Principe de la détection électrochimique du GSH

La détection électrochimique utilise les principes de base des réactions électrochimiques pour générer des signaux électriques (résistance, conductivité, potentiel, courant, potentiel, etc.) liés à la concentration de l'analyte cible afin de réaliser une détection qualitative et une analyse quantitative de la molécule cible. Les techniques de détection électrochimique les plus courantes comprennent la voltampérométrie cyclique (CV), la spectroscopie d'impédance électrochimique, l'ampérométrie, la chronoampérométrie, la voltampérométrie différentielle (DPV) et la voltampérométrie à ondes carrées (SWV). Le GSH lui-même est électrochimiquement actif, c'est-à-dire qu'il peut transférer des électrons avec la surface de l'électrode, et le GSH peut donc être détecté par des méthodes électrochimiques. La détection électrochimique du GSH peut être divisée en méthodes directes et indirectes. La méthode directe est basée sur le transfert direct d'électrons entre le GSH et l'électrode pour détecter quantitativement le GSH. Le principe est que le GSH est une substance réductrice avec des groupes sulfhydryles, et à un certain potentiel, il peut être oxydé à la surface de l'électrode par la perte de deux électrons et de deux protons, ce qui entraîne un courant d'oxydation (comme le montre la figure 1), et un courant d'oxydation est alors généré. Le courant d'oxydation peut être quantifié sur la base du courant d'oxydation généré pour détecter le GSH.

 

La méthode indirecte consiste à quantifier indirectement le GSH sur la base des signaux électriques d'autres produits chimiques. Le médiateur électronique a une bonne activité électrochimique et le principe de la méthode de détection indirecte du GSH basée sur le médiateur électronique est illustré à la figure 1[10] . Le médiateur électronique M génère d'abord le médiateur électronique oxydé Mox par transfert d'électrons à la surface de l'électrode, puis la réaction d'oxydation entre Mox et GSH se produit, ce qui oxyde le GSH en GSSG, et le Mox est réduit à la forme réduite du médiateur électronique Mred, et la quantification finale du GSH peut être effectuée indirectement sur la base du pic d'oxydation généré par Mred à la surface de l'électrode. Le pic d'oxydation généré par Mred à la surface de l'électrode a été utilisé pour quantifier indirectement le GSH. Les chercheurs peuvent choisir différents médiateurs électroniques en fonction des propriétés chimiques et électrochimiques du GSH afin d'améliorer la sensibilité et la sélectivité de la détection.

 

Outre la détection électrochimique indirecte du GSH basée sur les médiateurs électroniques, de nombreuses méthodes électrochimiques de détection du GSH ont été rapportées sur la base de la forte affinité du GSH pour divers ions métalliques ou nanomatériaux métalliques [11-13]. Le GSH possède un groupe sulfhydryl-SH, qui a une forte affinité pour Cu2+, Ag+, Hg2+, Pb2+, Co+ et les nanomatériaux Au, Ag, Cu, et ces ions métalliques tels que Cu2+, Ag+, Hg2+, et Pb2+ sont électrochimiquement actifs. Ces ions métalliques tels que Cu2+, Ag+, Hg2+, Pb2+ sont électrochimiquement actifs. Lorsque le GSH est ajouté au système de réaction, il peut se lier à ces ions métalliques ou nanomatériaux métalliques et provoquer une modification régulière de leurs signaux électrochimiques à différents degrés, de sorte que le GSH peut être quantifié indirectement sur la base des signaux électrochimiques modifiés.

En conclusion, la détection électrochimique directe du GSH est basée sur le signal électrochimique du GSH lui-même pour quantifier le GSH, tandis que la détection électrochimique indirecte du GSH est basée sur les signaux électrochimiques d'autres substances pour quantifier le GSH.

 

2 Electrodes de substrat

Les électrodes de substrat qui peuvent être utilisées pour détecter le GSH comprennent les électrodes de carbone vitreux, les électrodes d'or, les électrodes de mercure, les électrodes de pâte de carbone et les électrodes de platine. Les capteurs électrochimiques de glutathion basés sur des électrodes de mercure détectent le GSH grâce à l'oxydation du mercure à la surface pour former un complexe mercure-thiol. Ce comportement électrochimique se produit à un potentiel de +0,1 V. Le faible potentiel d'oxydation permet de détecter le GSH sans interférence avec d'autres substances physiologiquement actives telles que d'autres acides aminés, le glucose, l'acide ascorbique et l'acide urique. Cependant, les électrodes de mercure sont toxiques et la réponse électrochimique au GSH ralentit avec l'augmentation du temps de détection, et le comportement électrochimique est instable et peu reproductible.

 

Les oxydes de surface formés sur les électrodes de travail en platine et en or favorisent l'oxydation du GSH, mais les dépôts de sulfure à la surface des électrodes métalliques les rendent passives, ce qui ralentit le transfert d'électrons à mesure que le temps de détection augmente et accroît les sur-potentiels, ce qui complique considérablement l'application analytique. Les électrodes à base de carbone ont également été utilisées à maintes reprises pour la détection du GSH. Par exemple, l'électrode à base de carbone vitreux GC possède une large gamme de potentiels de travail et sa grande inertie chimique offre un degré élevé de précision dans la détection, ce qui la rend largement utilisée dans les analyses électrochimiques. Toutefois, sur l'électrode GC, le GSH n'est oxydé en GSSG qu'à un potentiel d'environ +1,0 V. Un potentiel d'oxydation aussi élevé indique que le GSH a un faible taux de transfert d'électrons sur l'électrode GC, qu'il a un surpotentiel important et qu'il est susceptible d'être perturbé par d'autres substances physiologiquement actives, ce qui constitue les inconvénients qui limitent l'utilisation directe de l'électrode GC nue pour la détection du GSH. Afin d'accélérer le taux de transfert d'électrons du GSH à la surface de l'électrode, de réduire le surpotentiel et d'empêcher la passivation de l'électrode pendant le processus de détection, la modification des nanomatériaux et des médiateurs d'électrons à la surface de l'électrode substrat a été appliquée à plusieurs reprises à la conception de capteurs électrochimiques de GSH. En modifiant les nanomatériaux à la surface de l'électrode et en immobilisant divers types d'activateurs de réduction oxydative, il est possible d'accélérer le taux de transfert d'électrons entre le GSH et l'électrode, de réduire le surpotentiel et d'améliorer la sensibilité et la sélectivité.

 

3 Application des nanomatériaux à la détection électrochimique du GSH

En raison de la faible sensibilité, de la mauvaise reproductibilité, de la lenteur du transfert d'électrons et du surpotentiel élevé des électrodes nues pour la détection électrochimique, la modification des électrodes est devenue très importante.Au 21e siècle, le développement rapide de la nanotechnologie a apporté de nouvelles contributions à la chimie électroanalytique. Les nanomatériaux sont des molécules dont la taille est comprise entre 1 et 100 nm, ce qui leur confère des propriétés uniques telles que l'effet d'interface de surface, l'effet de taille quantique et l'effet tunnel quantique. En modifiant divers nanomatériaux à la surface de l'électrode de travail, il est possible d'obtenir une interface de détection stable, sélective et réactive, ce qui améliore les performances analytiques. En raison des excellentes performances des nanomatériaux, leur développement dans le domaine de la recherche électrochimique a été encouragé et la détection électrochimique de substances peu actives a également été élargie. Par exemple, des nanomatériaux métalliques, y compris des nanoparticules d'or, des nanoparticules d'argent, des amas d'or, des amas de cuivre, des nanotubes de carbone et des nanomatériaux de graphène ont été utilisés dans la détection électrochimique du GSH.

 

Les nanotubes de carbone, y compris les nanotubes de carbone monoparois (SWCNT) et les nanotubes de carbone multiparois (MWCNT), dotés de bonnes propriétés conductrices et d'une surface spécifique élevée, ont été appliqués à la détection du GSH à de nombreuses reprises. La modification des nanotubes de carbone sur l'électrode de substrat peut accélérer le transfert d'électrons entre le GSH et la surface de l'électrode et réduire considérablement le surpotentiel. Par exemple, le potentiel de pic d'oxydation du GSH à l'électrode SWCNTs/GC est situé à +0,55 V, soit 0,45 V de moins qu'à l'électrode GC nue à +1,0 V. L'électrode GC modifiée avec des SWCNTs peut être utilisée pour la détection multiple du GSH, et la sensibilité de détection ne sera pas diminuée en raison de la passivation de l'électrode par la contamination.

 

Gong et al[14] ont utilisé des MWCNT dopés dans un gel de silicate pour préparer des électrodes composites céramique-nanotubes de carbone (CCNNE) pour la détermination du GSH. Les comportements électrochimiques des électrodes préparées par cette technique sol-gel sont accordables en fonction de la quantité de MWCNT dispersés dans le gel de silice, et les électrodes présentent des voltammogrammes cycliques d'électrodes de taille conventionnelle lorsqu'elles sont dopées avec une teneur élevée en MWCNT (supérieure à 1,5 mg/mL) ; et les électrodes présentent des voltammogrammes cycliques d'électrodes de taille normale lorsqu'elles sont modifiées avec une faible teneur en MWCNT (inférieure à 0,1 mg/mL). Lorsqu'il est dopé avec une teneur élevée en MWNT (supérieure à 1,5 mg/mL), la modification du matériau à la surface des électrodes GC permet aux électrodes de présenter des voltammogrammes cycliques de taille conventionnelle ; lorsqu'il est dopé avec une faible teneur en MWCNT (inférieure à 0,1 mg/mL), le matériau permet aux électrodes de présenter des voltammogrammes cycliques de microélectrodes, et le matériau a un effet électrocatalytique significatif sur l'oxydation du GSH. Le graphène (GR), y compris le graphène réduit (rGO) et le graphène oxydé (GO), est également un type de matériau carboné doté de bonnes propriétés électrochimiques catalytiques, et a été appliqué à la détection électrochimique du GSH à de nombreuses reprises. Yuan et al. [15] ont comparé les comportements électrochimiques du GSH sur des électrodes GO/GC obtenues par réduction à différents potentiels de réduction, et les résultats ont montré que le GO réduit à -0,75 V avait le meilleur effet électrocatalytique sur l'oxydation du GSH. Les résultats ont montré que le GO réduit à un potentiel de -0,75 V avait le meilleur effet électrocatalytique sur l'oxydation du GSH, et que l'oxydation du GSH pouvait se produire à +0,3 V. Ils ont attribué l'effet électrocatalytique aux groupes carboxyle et carbonyle à la périphérie du GO.

 

Afin de réduire davantage la limite de détection, divers nanomatériaux métalliques, y compris l'or, l'argent, le cuivre, le nickel, l'aluminium et le platine, ont été largement utilisés pour modifier la surface des électrodes pour la détection électrochimique du GSH.Dong et al.[16] ont utilisé une électrode GC (Ni-Al DHs/ GCE) basée sur la co-modification des MWCNT et des hydroxyles bis-hydroxylés en couche de nickel et d'aluminium électrodéposés (Ni-Al LDHs) en tant qu'électrode de travail. L'électrode de travail a été utilisée avec des MWCNTs/GCE. Les résultats expérimentaux ont démontré qu'en combinant Ni-AlLDHs et MWCNTs, le courant de réponse du GSH dans Ni-Al LDHs/MWCNTs/GCE était significativement plus élevé que dans MWCNTs/GCE et Ni-Al LDHs/GCE, et le potentiel de crête s'est déplacé vers le pôle négatif, et le courant anodique était plus de dix fois supérieur à celui de Ni-Al LDHs/GCE, avec une limite de détection allant jusqu'à 0,7 μM, ce qui a démontré que la combinaison Ni-Al LDHs et MWCNTs pouvait être utilisée comme électrode de travail. Stojanovi et al [17] ont utilisé une électrode à pâte de carbone (CPE) modifiée au Sb2 O3(trioxyde d'antimoine) comme électrode de travail pour détecter le GSH et le GSSG, et la limite de détection du GSH et du GSSG était de 0,7 μM, ce qui indique que la combinaison de Ni-Al LDHs et de MWCNTs avait un bon effet électrocatalytique sur le GSH et améliorait grandement la sensibilité de la détection. Les limites de détection du GSH et du GSSG étaient respectivement de 0,34 μM et de 0,10 μM pour le GSH et le GSSG. D'autres nanomatériaux tels que Pd, IrO2, TiO2, Cu, Pt, Au, MnO2, etc. [21-24], des nanomatériaux et des nanoclusters sous diverses formes, ainsi que des électrodes modifiées avec des composés de cadres métallo-organiques [11] ont également été utilisés pour la détection du GSH.

 

En conclusion, l'électrode de substrat modifiée par des nanomatériaux peut réduire le surpotentiel, augmenter la sensibilité et abaisser la limite de détection. Avec le développement de la science des matériaux, davantage de nanomatériaux sont utilisés pour modifier l'électrode de substrat afin d'améliorer la sensibilité de détection, mais l'ajout de matériaux modificateurs peut améliorer la sensibilité de l'objet testé et des interférents, mais la sélectivité de l'objet testé reste faible.

 

4 Application des médiateurs électroniques à la détection électrochimique du GSH

Outre les nanomatériaux, les médiateurs électroniques sont souvent modifiés à la surface des électrodes afin d'augmenter la sensibilité de la détection et d'améliorer la sélectivité de la méthode. Les médiateurs d'électrons ont généralement un faible poids moléculaire et transfèrent des électrons entre le matériau à mesurer et l'électrode, ce qui rend le matériau plus sensible à l'oxydoréduction à la surface de l'électrode. Différents médiateurs d'électrons peuvent être sélectionnés en fonction des propriétés chimiques et électrochimiques du matériau à mesurer.

 

En règle générale, lors de la sélection d'un médiateur d'électrons, la substance choisie doit tout d'abord présenter une bonne activité électrochimique, c'est-à-dire qu'elle doit transférer des électrons à la surface de l'électrode à un rythme rapide ; et deuxièmement, elle doit avoir un bon effet électrocatalytique sur la substance testée. Les médiateurs d'électrons signalés pour la détection électrochimique du GSH comprennent le ferrocène, les complexes de métalloporphyrine, les dérivés métalliques de la bipyridine, le 7,7,8,8-tétracyanoquinodiméthane, l'acétylamine ainsi que les catéchols et leurs dérivés, et il existe également d'autres médiateurs d'électrons pour la détection du GSH.Yuan et al.[20] ont signalé un médiateur d'électrons basé sur une combinaison de 7,7,8,8-tétracyanoquinodiméthane (TCNQ) et de quinolines contenant une cathode. Yuan et al[20] ont rapporté une électrode de carbone vitreux basée sur le 7 ,7 ,8 ,8-tétracyanoquinolinediméthane (TCNQ) et une électrode de carbone vitreux modifiée au graphène rGO pour la détection du GSH, le TCNQ étant le médiateur électronique et le rGO/GC l'électrode de travail. L'électrode de carbone vitreux modifiée par TCNQ/rGO était capable de détecter le GSH à -50 mV, ce qui réduisait le surpotentiel d'oxygénation du GSH, et présentait une large gamme linéaire et une faible limite de détection, et a été appliquée avec succès à la détermination du GSH dans les gouttes pour les yeux.

En conclusion, la conductivité et la capacité électrocatalytique supérieures des nouveaux nanomatériaux peuvent augmenter la sensibilité de la détection, tandis que la sélection de médiateurs électroniques appropriés peut améliorer la sélectivité de la détection électrochimique du GSH, de sorte qu'il existe plusieurs rapports sur la combinaison de nanomatériaux et de médiateurs électroniques pour la détection du GSH.

 

5 Conclusion

Le catéchol, le catéchol et ses dérivés (y compris le catéchol, la dopamine, l'acide caféique, la norépinéphrine, etc. Le catéchol et ses dérivés ont été utilisés comme médiateurs électroniques des thiols réduits, y compris le GSH, pendant de nombreuses années, et les deux mécanismes de réaction suivants peuvent être conclus à partir du résumé de plusieurs études : le premier est un mécanisme de réaction d'oxydation électrochimiquement catalysé (comme le montre la figure 3A). Dans ce mécanisme, le catéchol et ses dérivés agissent uniquement comme médiateurs d'électrons pour catalyser l'oxydation électrochimique des petites molécules thiols réduites à la surface de l'électrode, montrant ainsi un voltammogramme cyclique avec une augmentation du pic d'oxydation catalytique et une diminution du pic de réduction. Le second est le mécanisme de réaction ECE[22] (illustré à la figure 3B), c'est-à-dire que le médiateur d'électrons catéchol et ses dérivés A s'oxydent d'abord électrochimiquement à la surface de l'électrode pour produire l'o-benzoquinone B. Le groupe sulfhydryle de la petite molécule réduite mercaptan, SH, a une forte nucléophilie et attaque donc l'o-benzoquinone B dans une réaction de substitution nucléophile, ce qui donne le produit C substitué par le sulfhydryle. D peut être attaqué par le -SH d'une petite molécule réduite, le mercaptan, pour produire E ; E peut être oxydé électrochimiquement à la surface de l'électrode pour produire F.

 

Le potentiel d'oxydation électrochimique des produits mono- et dimercapto-substitués C et E est différent de celui du médiateur d'électrons catéchol et de son dérivé A, c'est-à-dire qu'un nouveau pic peut être trouvé dans le voltammogramme cyclique, et les thiols prototypiques réduits peuvent être quantifiés sur la base des valeurs actuelles des nouveaux pics.McCarley et al. ont suggéré que le GSH subit le deuxième mécanisme de réaction ECE, tandis que la cystéine et l'homocystéine, qui ont une structure similaire au GSH, subissent généralement le premier mécanisme de réaction, de sorte que de nombreux rapports ont basé la quantification du GSH sur la réaction du GSH avec le catéchol et son dérivé afin de produire de nouveaux pics. McCarley et al. ont suggéré que le GSH subit le deuxième mécanisme de réaction ECE, tandis que la cystéine et l'homocystéine, dont la structure est similaire à celle du GSH, subissent généralement le premier mécanisme de réaction. Dans notre groupe[23], le GSH a été quantifié indirectement sur la base de la formation du produit de substitution catéchol-GSH et du pic d'oxydation du produit. Le nouveau pic se situait à -0,16 V, ce qui était plus négatif que le potentiel du pic d'oxydation de 0,60 V pour le GSH et de 0,20 V pour l'o-phénol, et d'autres thiols et d'autres substances physiologiquement actives n'interféraient pratiquement pas avec la détection du GSH dans une certaine gamme de concentrations à ce potentiel. Ce travail fournit une méthode hautement sélective pour la détection du GSH. Ce travail fournit un test GSH hautement sélectif pour la détermination de la fuite intracellulaire de GSH après l'apoptose induite par l'adriamycine dans les cellules HeLa.

 

Compte tenu des rôles physiologiques et pathologiques importants du glutathion réduit GSH, la détermination précise et rapide du GSH dans les organismes est essentielle. Dans cet article, les principes, les avantages et les inconvénients des méthodes de détermination du GSH développées sur la base de techniques électrochimiques ont été analysés en profondeur en termes d'électrode de substrat, de nanomatériaux et de médiateurs électroniques. La sensibilité et la sélectivité de la méthode ont été améliorées en sélectionnant l'électrode de substrat et en combinant les nanomatériaux et les médiateurs électroniques.

 

Compte tenu des exigences actuelles de la chimie analytique, les méthodes électrochimiques établies doivent encore être appliquées aux tests cliniques et aux analyses sur le terrain, de sorte que la miniaturisation des électrodes et la mise au point d'électrodes de test jetables constituent la tendance future du développement. Cependant, les problèmes sont les suivants : pour le développement de microélectrodes et d'électrodes jetables à faible coût, des méthodes de modification trop compliquées sur la surface de l'électrode ne seront pas applicables ; les matériaux et méthodes de modification trop coûteux seront abandonnés ; en outre, les méthodes électrochimiques établies doivent être transférées des électrodes conventionnelles aux microélectrodes et aux électrodes jetables, et la modification des électrodes deviendra compliquée ; même si la même méthode et les mêmes matériaux de modification sont utilisés pour les microélectrodes, la même méthode et les mêmes matériaux de modification seront utilisés pour les microélectrodes, ce qui entraînera une sensibilité plus élevée par rapport aux électrodes conventionnelles. Même si la même méthode et le même matériau modifié sont utilisés pour les microélectrodes, la sensibilité est réduite ou même le comportement électrochimique est différent de celui des électrodes conventionnelles. Les chercheurs doivent continuer à explorer et à trouver les matériaux et les méthodes de modification d'électrode appropriés pour les dispositifs de détection microélectrochimique, afin de garantir une activité catalytique et une sélectivité élevées des matériaux de modification, ainsi que la précision de la détection, tout en facilitant la détection et en la rendant moins onéreuse.

 

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Sélection par mutagenèse et optimisation de la fermentation de levures de bière produisant du glutathion extracellulaire

Le glutathion (GSH), ou γ-glutamyl-L-cystéine-glycine, est un acide aminé comprenant trois acides aminés (glutamate, cystéine et glycine) dans la glutamylcystéine synthétase et la glutathion synthétase.

Le GSH est un tripeptide thiol non protéique synthétisé sous action continue [1], qui joue un rôle important dans la protection des cellules contre les dommages causés par les antioxydants et dans le maintien de l'homéostasie intracellulaire [2-4].Le GSH est largement utilisé dans des domaines industriels tels que l'alimentation [5-7], les cosmétiques [8] et les produits pharmaceutiques [9-12], et il peut être utilisé comme antioxydant et agent aromatique, ce qui permet de prévenir efficacement le brunissement des aliments et de préserver leur saveur unique [13-16], et il peut être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui permet de protéger les reins et d'améliorer la désintoxication du foie [17-18].Le GSH peut également être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui permet de protéger les reins et d'améliorer la désintoxication du foie [17-18]. Le GSH peut également être utilisé comme piégeur de radicaux libres, ce qui peut protéger les reins et améliorer la capacité de détoxification du foie [17-18].

 

La fermentation microbienne est actuellement la méthode la plus courante pour la production industrielle de GSH [19-20], mais comme il s'agit d'un produit intracellulaire, la productivité et les avantages économiques de l'extraction du GSH en aval de la fermentation ne peuvent pas répondre efficacement à la demande du marché, ce qui limite le développement de son industrialisation dans une certaine mesure. Si le GSH intracellulaire des souches de fermentation peut être efficacement sécrété dans l'extracellulaire, le GSH purifié peut être préparé directement dans le bouillon de fermentation, ce qui simplifie le processus d'extraction et réduit la difficulté de l'isolement et de la purification du GSH en aval, améliorant ainsi la productivité du GSH. Si le GSH intracellulaire peut être efficacement sécrété vers l'extracellulaire, le GSH peut alors être directement préparé et purifié dans le bouillon de fermentation, ce qui simplifie le processus d'extraction et réduit la difficulté de l'isolement et de la purification du GSH en aval, augmentant ainsi la productivité du GSH. Ces dernières années, la question de savoir comment obtenir des souches de fermentation productrices de GSH extracellulaire a attiré l'attention des chercheurs nationaux et étrangers[21] . Par exemple, l'utilisation de la technologie du génie génétique pour améliorer le transport extracellulaire du GSH par les souches de fermentation[22-24] , ou pour améliorer la perméabilité de la membrane cellulaire afin de promouvoir l'exocytose et l'accumulation du glutathion. Cependant, les coûts de modification et les exigences techniques pour la construction de bactéries de fermentation extracellulaire pour l'ingénierie du glutathion sont élevés, et la régulation de la perméabilité de la membrane cellulaire est une méthode de pénétration chimique à base de réactifs organiques [25], qui ne convient pas à la production industrielle compte tenu de l'impact sur l'activité de croissance des souches et sur l'environnement.

 

La technique traditionnelle de sélection par mutagenèse UV est non seulement simple et rapide pour sélectionner les souches cibles, mais elle garantit également la stabilité génétique des souches mutantes[26] , cependant, seules les souches mutantes produisant du glutathion intracellulaire, mais pas les souches mutantes produisant du glutathion extracellulaire, ont été sélectionnées par mutagenèse UV dans l'étude actuelle[27-29] . Par conséquent, dans la présente étude, nous avons utilisé Saccharmyces cere- visiae GAQ4 comme souche de départ, et sélectionné une souche mutante génétiquement stable avec une production élevée de glutathion extracellulaire par mutagenèse UV, et augmenté la production de GSH extracellulaire en optimisant les conditions de fermentation, afin de fournir une nouvelle référence pour la stratégie de fermentation extracellulaire du GSH et de parvenir à la production industrielle de la fermentation extracellulaire du GSH. Les résultats fourniront une nouvelle référence pour la stratégie de fermentation extracellulaire du GSH et la production industrielle de GSH.

 

1 Matériel et méthodes

1.1 Matériaux et réactifs

Saccharomyces cerevisiae GAQ4 : fermentation industrielle dans le laboratoire clé du ministère de l'éducation, université de technologie du Hubei, centre d'innovation collaborative de la province du Hubei, laboratoire A610.

Glucose, poudre de levure, peptone, sulfate d'ammonium, dihydrogénophosphate de potassium, sulfate de magnésium anhydre, poudre d'agar, acide phosphorique (tous analytiquement purs) : Sinopharm Chemical Reagent Corporation ; 1-heptanesulfonate de sodium, glutathion (tous analytiquement purs) : Shanghai McLean Biochemistry Technology Co.

 

1.2 Instruments et équipements

Banc de purification unique SW-CJ-1D : Suzhou Purification Equipment Co., Ltd ; Incubateur biochimique automatique ZSD-12 : Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Co. PH-mètre universel Sartorius (PB-10) : Sartorius (Shanghai) Trading Co., Ltd ; four de séchage électrothermique à température constante : Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co.

 

1.3 Méthode d'essai

1.3.1 Méthodes de culture

Milieu liquide des semences : glucose 20 g/L, peptone 20 g/L, levure chimique 10 g/L, pH naturel.

Milieu solide des semences : glucose 20 g/L, peptone 20 g/L, bicarbonate de soude 10 g/L, agar 20 g/L, pH naturel.

Milieu de fermentation : glucose 20 g/L, levure 10 g/L, sulfate d'ammonium 8 g/L, dihydrogénophosphate de potassium 3 g/L, sulfate de magnésium 0,15 g/L, pH naturel.

Culture de semences : prendre la suspension bactérienne conservée dans des tubes de glycérol et l'insérer dans le milieu de semences, et l'incuber à 30 ℃ et 180 r/min de vitesse d'agitation.

Culture de fermentation : prendre la sève de semence en période de croissance logarithmique et la placer dans le milieu de fermentation avec un volume d'inoculum de 10 % en volume, et l'incuber à une température de 30 ℃ et à une vitesse de 180 r/min en agitant le flacon.

 

1.3.2 Mutagenèse aux ultraviolets

Processus de mutagenèse : préchauffer une lampe UV de 15 W pendant 20 minutes. Prendre la suspension bactérienne de semence en période de croissance logarithmique, diluer la suspension au nombre de cellules de 107 CFU/mL~108 CFU/mL, prendre 200 μL de la solution de dilution et l'étaler sur le milieu solide de semence, puis placer immédiatement la plaque de milieu à une distance de 30 cm de la lampe UV pour l'irradiation UV, le temps d'irradiation était de 10, 20, 30, 40, 50 et 60 s, et chaque groupe a été mis en place en 3 parallèles, et le nombre de colonies bactériennes uniques cultivées sur chaque plaque a été compté. Immédiatement après l'irradiation, les plaques ont été placées à l'envers dans un incubateur à 30 ℃ pour éviter la lumière, et le nombre de colonies uniques cultivées sur chaque plaque a été compté. La suspension bactérienne diluée sans irradiation UV a été étalée sur un milieu solide, puis incubée dans le groupe témoin, qui était protégé de la lumière. Calculer la létalité mutagène UV, prendre le temps d'irradiation UV comme coordonnée horizontale et la létalité mutagène UV comme coordonnée verticale, et tracer la courbe de létalité mutagène UV. La formule de calcul de la létalité mutagène est la suivante.

 

Létalité mutagène/% = (nombre de colonies sur la plaque de contrôle - nombre de colonies sur la plaque mutagénisée)/nombre de colonies sur la plaque de contrôle × 100.

Mutagenèse UV itérative : en utilisant la teneur en GSH extracellulaire de la souche comme indice de sélection, le GAQ4 a été soumis à une mutagenèse UV itérative, c'est-à-dire que les souches mutantes qui répondaient aux indices de sélection obtenus lors de la mutation précédente ont été utilisées comme souches de départ dans la mutation suivante, puis la sélection des mutations a été effectuée à nouveau. Trois groupes parallèles ont été établis pour chaque mutagenèse afin d'obtenir un nombre suffisant de souches mutantes et d'augmenter le taux de mutation positive. Chaque mutagenèse UV doit être comparée à la courbe de létalité de la mutagenèse UV afin de sélectionner la dose mutagène optimale pour chaque génération de souches mutantes.

 

Test de stabilité génétique : afin de confirmer que les souches cibles obtenues ont une bonne stabilité génétique, les souches cibles sélectionnées ont été passées successivement 8 fois, et la culture de fermentation a été effectuée sur les 1ère, 4ème et 8ème générations, et la teneur en glutathion extracellulaire de la production de fermentation a été mesurée par rapport au contrôle de la souche de départ GAQ4. 1.3.3 Test à sens unique des conditions de fermentation

Un test à sens unique a été réalisé pour étudier les effets de la période de fermentation, du volume de la fiole d'agitation, du pH initial, de la température de fermentation et de la vitesse de rotation de la fiole d'agitation sur la teneur en GSH extracellulaire produite par la fermentation en fiole d'agitation des souches mutantes, en utilisant la teneur en GSH extracellulaire comme indicateur. La température de fermentation était de 26, 30, 34, 38 et 42 ℃, et la vitesse de rotation du ballon d'agitation était de 120, 140, 160, 180 et 200 r/min. Les conditions de fermentation en ballon d'agitation des souches mutantes ont été optimisées, et les conditions optimales de fermentation en ballon d'agitation ont été déterminées en établissant trois parallèles pour chaque facteur et en prenant la valeur moyenne.

 

1.3.4 Mesure de la biomasse

Un certain volume de suspension bactérienne a été centrifugé à 8000 r/min pendant 5 minutes pour recueillir le corps bactérien humide, et le corps bactérien a été lavé avec de l'eau stérile pendant 3 fois, puis séché dans une étuve à 65 ℃ jusqu'à obtention d'un poids constant, et ensuite pesé pour obtenir le poids sec des cellules, et la biomasse a été calculée par la formule suivante.

Biomasse/(g/L) = poids sec des cellules (g) / volume de la suspension bactérienne (L)

 

1.3.5 Détermination du glutathion

La teneur en GSH a été déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) [30]. Les conditions chromatographiques étaient les suivantes : la colonne était une Inertsil ODS-SP C18, et les phases mobiles étaient un tampon heptanesulfonate-phosphate de sodium (6,8 g de 1-heptanesulfonate de sodium, 2,2 g de phosphate de potassium, pH 3,0 ajusté avec de l'acide phosphorique, et du méthanol (90:10 tampon phosphate/méthanol, rapport en volume) à un débit de 1,0 mL/min. Les phases mobiles étaient une solution de tampon phosphate-heptanesulfonate de sodium (6,8 g de 1-heptanesulfonate de sodium, 2,2 g de dihydrogénophosphate de potassium, pH 3,0 ajusté avec de l'acide phosphorique, et de l'eau ultrapure ajustée à 1 L) et du méthanol (le rapport en volume entre le tampon phosphate et le méthanol était de 90:10) à un débit de 1,0 mL/min.

Peser 10 mg d'étalon de glutathion, le diluer dans 10 ml d'eau ultrapure, puis le diluer aux concentrations de 200, 400, 600, 800 et 1 000 mg/L. Les zones de pic correspondant aux différentes concentrations de GSH ont été détectées par la méthode CLHP, et la courbe standard a été tracée par la méthode CLHP avec la concentration de GSH comme coordonnée horizontale et la zone de pic comme coordonnée verticale (comme dans la figure 1), et l'équation de régression de la courbe standard était y=18 045x+168 919, R2 =0,999 3. La courbe standard a été tracée avec la concentration de GSH comme coordonnée horizontale et la surface du pic comme coordonnée verticale (figure 1), et l'équation de régression de la courbe standard était y=18 045x+168 919 avec R2 =0,999 3, ce qui a été utilisé pour le calcul de la teneur en GSH.

 

2 Résultats et analyses

2.1 Résultats de l'élevage par mutagenèse

 

2.1.1 Teneur en GSH extracellulaire de la souche de départ GAQ4

La teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 était de 7,37 mg/L après une fermentation en fiole agitée pendant 48 h. La teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 a été utilisée comme indicateur de la souche de départ, et la teneur en glutathion extracellulaire de GAQ4 a été comparée à celle du mutant obtenu par mutagénèse.

 

2.1.2 Résultats du criblage par mutagenèse UV

En utilisant la teneur en GSH extracellulaire comme indice de criblage, la souche de départ GAQ4 a été soumise à une mutagenèse UV itérative selon la méthode décrite au point 1.3.2. Les résultats du premier criblage par mutagenèse UV sont présentés à la figure 2.

Au total, 200 colonies individuelles ont été prélevées après le premier traitement par irradiation UV, et 15 souches mutantes ont été sélectionnées parmi les souches de criblage primaire sur la base de la teneur élevée en glutathion extracellulaire après fermentation (Fig. 2B), parmi lesquelles la teneur en glutathion extracellulaire du mutant UV1-6 était de 13,87 mg/L, soit une augmentation de 88,20 % par rapport à la souche de départ, et a été sélectionnée pour poursuivre le criblage par mutagénèse UV. La souche mutante UV1-6 a été sélectionnée pour poursuivre le criblage par mutagenèse UV.

 

Le mutant UV1-6 a été utilisé comme souche de départ pour la deuxième mutagenèse UV, et les résultats du criblage de la deuxième mutagenèse UV sont présentés dans la Fig. 3. D'après la Fig. 3A, on peut voir que la souche mutante a montré un taux de létalité de 78,6 % lorsqu'elle a été irradiée aux UV pendant 30 s, ce qui est plus élevé que la mutagenèse précédente à la même dose, de sorte que nous avons encore choisi d'utiliser la même dose d'irradiation aux UV pour le deuxième traitement de mutagenèse UV.

Comme le montre la figure 3B, 14 souches mutantes ayant une teneur en glutathion extracellulaire relativement élevée ont été sélectionnées après le deuxième criblage par mutagenèse UV, parmi lesquelles la souche mutante UV2-2 avait une teneur en glutathion extracellulaire de 16,10 mg/L, soit 118,45 % et 16,08 % de plus que la souche de départ GAQ4 et la souche mutante UV1-6, respectivement.

Le mutant UV2-2 a été soumis à un troisième traitement de mutagenèse UV, et les résultats sont présentés dans la figure 4.

 

Comme le montre la figure 4A, la létalité de la troisième mutation UV a manifestement augmenté après la même dose mutagène, et la létalité a atteint 69,5 % à 10 s d'irradiation UV, et 81,9 % à 20 s d'irradiation UV, de sorte que 15 s d'irradiation UV ont été choisis comme durée du traitement de la troisième mutation. Après le criblage, 11 mutants présentant une teneur élevée en GSH extracellulaire ont été obtenus. Comme le montre la figure 4B, la teneur en GSH extracellulaire du mutant UV3-10 obtenu par la troisième mutagenèse était de 19,08 mg/L, soit 158,89 %, 37,56 % et 18,51 % de plus que celle de la souche de départ, du mutant UV1-6 et du mutant UV2-2, respectivement. L'analyse ci-dessus a montré que l'effet de mutation positive de la troisième mutagenèse n'était pas aussi évident que celui des deux précédentes, que la teneur en glutathion extracellulaire n'augmentait que pour un petit nombre de mutants examinés et que la teneur de certains mutants était même inférieure à celle d'avant la troisième mutagenèse, et que la létalité de la mutagenèse UV sous la même dose mutagène augmentait progressivement, ce qui dépassait la gamme de létalité de la mutation positive à haute probabilité. Par conséquent, les souches mutantes UV1-6, UV2-2 et UV3-10 obtenues lors du troisième criblage de mutagenèse UV ont été sélectionnées pour le test suivant.

 

2.1.3 Résultats de la stabilité génétique

Les souches mutantes UV 1-6, UV 2-2 et UV 3-10 obtenues à partir de trois criblages par mutagenèse UV ont été passées successivement huit fois, et les teneurs en glutathion extracellulaire ont été déterminées après la culture de fermentation de la première génération, de la quatrième génération et de la huitième génération, respectivement, et les résultats sont présentés dans le tableau 1.

La teneur en glutathion extracellulaire la plus élevée (18,56 mg/l) a été observée chez UV 3-10 à la 8e génération, et la performance de fermentation d'UV 3-10 dans la production de glutathion extracellulaire était génétiquement stable, de sorte qu'UV 3-10 a été sélectionnée comme souche cible.

 

2.2 Optimisation des conditions de fermentation

Dans les conditions initiales de fermentation en ballon d'agitation, c'est-à-dire un volume de remplissage de 100 mL/300 mL, un pH initial naturel, une température de fermentation de 30 ℃ et une vitesse de rotation de 180 r/min, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante était de 18,56 mg/L et la biomasse de la souche mutante était de 5,64 g/L. Des expériences d'optimisation à un facteur ont été réalisées pour le cycle de fermentation, le volume de remplissage du ballon d'agitation, le pH initial, la température de fermentation et la vitesse de rotation de la souche mutante, respectivement. Le cycle de fermentation, le volume de remplissage du ballon d'agitation, la valeur pH initiale, la température de fermentation et la vitesse de rotation du ballon d'agitation ont été optimisés par un test d'optimisation à un facteur. Les effets de la période de fermentation sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible UV3-10 sont présentés dans la figure 5.

 

Comme le montre la figure 5, la teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante a augmenté puis diminué avec l'allongement de la durée de fermentation. La teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante était de 18,97 mg/L à la durée de fermentation de 48 h. La teneur en glutathion extracellulaire a commencé à diminuer avec l'allongement de la durée de fermentation, c'est pourquoi 48 h a été choisi comme durée de fermentation, et d'autres conditions de fermentation ont été optimisées sur cette base.

L'effet du volume de l'agitateur sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 6.

 

 La figure 6 montre que la teneur en glutathion extracellulaire la plus élevée de la souche cible a été obtenue lorsque le volume de liquide du ballon d'agitation était de 75 mL/300 mL, et que lorsque le volume de liquide du ballon d'agitation augmentait progressivement, la teneur en glutathion extracellulaire commençait à diminuer, et que le volume élevé de liquide du ballon d'agitation affectait l'oxygène dissous dans le ballon d'agitation, affectant ainsi la fermentation de la souche cible, de sorte que le volume optimal de liquide du ballon d'agitation de 75 mL/300 mL a été choisi.

Les résultats de l'optimisation du pH initial de l'agitateur mutant sont présentés dans la figure 7.

 

Lorsque la valeur initiale du pH est passée de 5,0 à 6,0, la teneur en glutathion extracellulaire n'a pas beaucoup changé, mais lorsque la valeur du pH a été portée à 6,5, la teneur en glutathion extracellulaire a augmenté rapidement jusqu'à 36,42 mg/L, puis a commencé à diminuer avec l'augmentation de la valeur du pH, et a atteint la valeur maximale à pH 6,5.

L'effet de la température de fermentation sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 8.

 

 Comme le montre la figure 8, la température de fermentation a eu un effet plus important sur la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible que les autres facteurs, et l'augmentation de la température de fermentation a favorisé la sécrétion de glutathion extracellulaire par la souche mutante[31] . La teneur en glutathion extracellulaire a augmenté avec la température de fermentation et a atteint 40,63 mg/L à 34 ℃, soit 1,68 fois plus qu'à 30 ℃. Lorsque la température de fermentation a été portée à 34 ℃, la teneur en glutathion extracellulaire a atteint 40,63 mg/L, soit 1,68 fois la température de fermentation de 30 ℃. Lorsque la température de fermentation a été portée à 42 ℃, la teneur en glutathion extracellulaire de la souche mutante a atteint 17,15 mg/L, et la biomasse de la souche mutante a chuté au niveau le plus bas, soit 3,16 g/L. Par conséquent, la température de fermentation optimale a été fixée à 34 ℃.

L'effet de la vitesse d'agitation du ballon sur la production de glutathion extracellulaire par la souche cible est illustré dans la figure 9.

 

La quantité d'oxygène dissous dans le ballon à agitation a été affectée par la quantité de liquide chargée dans le ballon et la vitesse de rotation, la force de cisaillement générée par la vitesse de rotation du ballon, le taux de transfert de masse et la quantité de liquide chargée dans le ballon ont eu un effet sur la quantité d'inoculum, l'état de croissance et la synthèse et l'accumulation des produits de fermentation des souches, comme on peut le voir sur la figure 9, la teneur en glutathion extracellulaire était la plus élevée lorsque la vitesse de rotation du ballon à agitation était de 140 r/min, et la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible avant l'optimisation. La teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois la teneur en glutathion extracellulaire de la souche cible avant optimisation.

 

Après l'optimisation de la fermentation en flacon à agitation, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante a atteint 52,05 mg/L après 48 h de fermentation, soit 2,80 fois plus que la fermentation pré-optimisée, avec un volume de remplissage du flacon à agitation de 75 mL/300 mL, un pH initial de fermentation de 6,5, une température de fermentation de 34 ℃ et une vitesse de rotation de 140 r/min.

 

3. la discussion et les conclusions

Dans cette étude, la souche mutante UV3-10 a été sélectionnée pour la production de GSH extracellulaire par mutagenèse UV itérative, et sa teneur en GSH extracellulaire était de 18,56 mg/L. Les conditions optimales pour la fermentation en flacon à agitation ont été obtenues par un test à sens unique, qui comprenait une période de fermentation de 48 h, un volume de chargement de 75 mL/300 mL, un pH initial de 6,5, une température de fermentation de 34 ℃, et une vitesse de rotation de 140 r/min. Après l'optimisation, la teneur en GSH extracellulaire de la souche mutante était de 52,05 mg/L, soit 2,80 fois plus élevée qu'avant l'optimisation.

 

Le mécanisme de sécrétion extracellulaire de la souche mutante UV3-10 a été proposé comme suit : la perméabilité cellulaire de la souche mutante a été modifiée après la mutagenèse, c'est-à-dire que l'activité de certaines protéines exportatrices de GSH a été renforcée ou que l'activité de certaines protéines dégradant le GSH a été inhibée après la mutagenèse, de sorte que les substances intracellulaires des cellules de levure ont spécifiquement débordé vers les zones extracellulaires, et l'accumulation extracellulaire de GSH a été générée dans des conditions de fermentation normales. La relation entre les activités des protéines de transport du glutathion et du système de synthétase du GSH des souches mutantes et leur mécanisme de sécrétion extracellulaire peut être étudiée dans des études ultérieures, et la manière de maintenir la stabilité du GSH extracellulaire en aval de la fermentation est également une question à étudier.

 

La souche mutante UV3-10 peut secréter le GSH synthétisé intracellulaire en extracellulaire, réalisant ainsi l'accumulation effective de GSH extracellulaire, ce qui améliore considérablement la possibilité de préparation industrielle de GSH dans le bouillon de fermentation, et réduit la difficulté de purification et d'isolation par rapport à l'extraction de GSH intracellulaire, économisant ainsi les coûts de production et la consommation d'énergie. En outre, Saccharomyces cerevisiae est une souche de sécurité alimentaire très appréciée des développeurs de produits alimentaires, et les résultats de l'étude sur la production de GSH extracellulaire par fermentation de Saccharomyces cerevisiae ouvrent de nouvelles perspectives et présentent des avantages économiques pour son application dans la transformation, le stockage et la conservation des aliments, ainsi que dans les arômes fonctionnels.

 

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