Le glutathion réduit (GSH) est composé de L-hemi, γ,-[et 1-2 en], contenant des groupes fonctionnels sulfhydryl, γ-glutamyl et autres, et présente des propriétés antioxydantes, de détoxification, de piégeage des radicaux libres, d'anti-radiation, et de maintien des fonctions normales des protéines et du système immunitaire[3] . Cependant, le GSH a un cycle de circulation court dans l'organisme, il est facilement oxydé et ne peut pas traverser la membrane cellulaire, ce qui limite son application dans les soins de santé et les traitements médicaux[4-5] . Des études ont montré que la technologie du micro- et du nanoembedding peut améliorer efficacement la stabilité du GSH et sa capacité à traverser la membrane cellulaire[6] . Naji-tabasi et al[8] ont utilisé la gomme de graines de basilic pour incorporer le GSH, et les nanoparticules de GSH préparées présentaient une bonne stabilité dans l'environnement gastro-intestinal. En outre, Joy et al[9] ont constaté que le GSH incorporé dans des nanoparticules de liposomes améliorait l'administration de médicaments au cerveau.
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Les liposomes, sortes de micro-vésicules formées par une bicouche lipidique enveloppée dans une solution aqueuse, sont capables d'intégrer non seulement des composés lipophiles, mais aussi des composés hydrophiles[10] . Lorsque le GSH est incorporé dans des liposomes, la bicouche peut réduire l'influence des facteurs environnementaux tels que l'oxygène et les ions métalliques sur le GSH, et augmenter la stabilité du GSH ; en outre, comme la bicouche phospholipidique a une forte affinité pour la membrane cellulaire, il est plus facile de transporter le GSH dans la cellule, et elle peut éviter la décomposition et la destruction du GSH, de sorte que le GSH peut être libéré lentement et que la biodisponibilité du GSH peut être améliorée[11] . Il existe de nombreuses méthodes d'incorporation du GSH dans les liposomes, telles que la méthode du gradient de pH, la méthode de l'éthanol et la méthode de production du GSH.
méthode d'injection, méthode d'évaporation en phase inversée et méthode des ultrasons en couche mince[12] . Dans le présent document, nous utilisons
Facteurs d'influence (par exemple, quantité de lécithine ajoutée, quantité de Tween-80 ajoutée,
Les interactions entre l'ajout de GSH, le temps de sonication et le rapport lécithine-cholestérol ont été étudiées afin d'obtenir les paramètres de traitement optimaux pour les nanoliposomes à haute teneur en GSH, qui fourniraient une base théorique et expérimentale pour leur application dans les industries alimentaires et médicales.
1 Matériel et méthodes
1.1 Matériaux et réactifs
Glutathion réduit (GSH), Shandong Jincheng Bio-Pharmaceutical Co. Ltd ; lécithine de soja, Shanghai McLean Biochemical Technology Co. Ltd ; cholestérol, Soleilbao Bio-technology Co.
1.2 Instruments et équipements
Concasseur à ultrasons JY99-Ⅱ D, Beijing Jiayuan Xingye Technology Co.
Ltd ; étiqueteuse enzymatique Multiskan FC, Thermo Fisher (Shanghai) Instruments Ltd ; centrifugeuse 5039R, Eppendorf, Allemagne ;
FE20pH Meter, METTLER TOLEDO INSTRUMENTS INC.
1.3 Méthode d'essai
1 .3 . 1 Tracé des courbes étalons de GSH
La réaction produit de l'acide 2-nitro-5-mercaptobenzoïque et du disulfure de glutathion, et l'acide 2-nitro-5-mercaptobenzoïque a une couleur jaune avec une valeur d'absorption maximale à 412 nm[13] . Dissoudre 1 mg d'étalon de GSH dans 1 ml d'eau distillée pour obtenir une solution mère de GSH d'une concentration massique de 1 mg/ml. Ensuite, conformément aux instructions du kit de test du glutathion réduit, ajouter 20 μL de la solution étalon, 140 μL du réactif 2 et 40 μL du réactif 3 dans un tube à centrifuger, bien mélanger et laisser reposer pendant 2 min avant d'analyser à 412 nm. L'absorbance a été mesurée à 412 nm après 2 minutes d'attente. La concentration massique de GSH a été prise comme coordonnée horizontale, et l'absorbance à 412 nm a été prise comme coordonnée verticale, et la courbe standard de GSH a été tracée.
1 .3 .2 Préparation de nanoliposomes de glutathion réduit
Dans cet article, des nanoliposomes incorporant du GSH (GLip) ont été préparés selon la méthode de sonication en couche mince de Lasicd[14] . Une certaine quantité de lécithine, de cholestérol et de Tween-80 a été dissoute dans 15 mL d'éthanol anhydre, et la solution mélangée a été versée dans un ballon à fond rond et évaporée par rotation à 50 ℃ et - 0,1 MPa pour éliminer la phase organique et former un film homogène et transparent sur la paroi du ballon. Ensuite, ajouter 20 mL, 0,05 mol/L, pH 6,0 de solution PBS à 50 ℃, dans les conditions de pression atmosphérique pour continuer l'hydratation rotative pendant 30 min pour laver le film ; après le film a été lavé, la solution de tampon phosphate (PBS) dans un bain de glace à 250 W de puissance pour l'ultrasonication, le traitement de 1 s travail 1 s pause 1 s mode, à 20 ℃ statique pendant 2 h, le GLip obtenu. L'échantillon de GLip a été transféré dans le tube intérieur d'un tube de centrifugeuse à ultrafiltration (avec un seuil de poids moléculaire de 10 kDa) et centrifugé à 3 000 r/min pendant 20 min pour recueillir le filtrat dans le tube extérieur du tube de centrifugeuse à ultrafiltration. Ajouter 2 ml d'eau distillée au tube intérieur, redistribuer la solution concentrée de GLip et centrifuger à nouveau à 3 000 r/min pendant 20 min, en recueillant le filtrat dans le tube extérieur du tube de centrifugation par ultrafiltration. Cette étape est répétée trois fois afin de séparer le matériel ne formant pas de GLip des GLip. Enfin, le concentré de GLip dans le tube intérieur du tube de centrifugation par ultrafiltration est complètement éliminé, et le filtrat recueilli est complètement mélangé et stocké à 4 °C, en attendant d'être déterminé.
1 .3 .3 Détermination du taux d'incorporation de GLip
Pipetter 100 μL de filtrat dans le tube extérieur du tube de centrifugeuse à ultrafiltration et le diluer de manière appropriée. Après une dilution appropriée, la teneur en GSH libre dans le filtrat a été déterminée selon la méthode décrite au point 1.3.1 et la courbe standard du GSH, et le taux d'incorporation du GSH dans le GLip a été calculé selon l'équation (1).
Taux d'inclusion ×100%, (1) où :Wtotal est la quantité totale de GSH ajoutée pendant la préparation ; Wfree est la quantité de GSH libre mesurée.
1 .3 .4 Optimisation des paramètres du processus
Dans le processus de préparation des GLip, les quantités de lécithine (100, 150, 200, 250, 300, 350 mg), de Tween-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 mg), de GSH (30, 40, 50, 60, 70, 80 mg), le temps de sonication (5, 10, 15, 20, 25, 30 min) et le rapport de masse entre lécithine et cholestérol (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) ont été déterminés en utilisant le taux d'enrobage comme indicateur, Sur la base des résultats des expériences à sens unique, les expériences d'analyse de la surface de réponse (RSA) avec 17 points expérimentaux à trois facteurs et trois niveaux ont été conçues avec l'ajout de lécithine, de GSH et de Tween-80 comme variables indépendantes.
1 .3 .5 Détermination de la taille des particules de GLip
1 mL de l'échantillon GLip a été dilué 10 fois avec de l'eau ultrapure, puis la taille des particules et la charge de surface de l'échantillon ont été déterminées par un analyseur potentiométrique de la taille des particules à 20 ℃, et l'indice de réfraction des phospholipides et des milieux dispersifs était de 1 . 330. Chaque échantillon a été mesuré plus de 3 fois en parallèle.
1 .3 .6 Traitement et analyse des données
L'analyse de la surface de réponse a été réalisée à l'aide du logiciel Design-Expert V8.0.6. Le logiciel Design-Expert V8.0.6 a permis d'ajuster une équation polynomiale de second ordre, et les coefficients de l'équation de régression linéaire ont été soumis à un test de signification (test F) afin de résumer les effets des facteurs uniques sélectionnés sur le taux d'incorporation de GSH dans GLip. Les équations polynomiales du second ordre obtenues ont été transformées en surfaces de réponse à l'aide du logiciel Design-Expert V8.0.6 afin d'analyser plus en détail les effets des facteurs expérimentaux et des niveaux sur le taux d'incorporation du GLip[15] .
2 Résultats et discussion
2.1 Mesure de la teneur en GSH
La courbe standard du GSH selon 1.3.1 est présentée dans la Fig. 1. La courbe standard du GSH a été tracée conformément au point 1.3.1, comme le montre la figure 1. Comme on peut le voir sur la Fig. 1, la concentration massique de GSH a montré une bonne relation linéaire avec l'absorbance dans la gamme de 0~200 μg/mL, et l'équation linéaire était y = 0,002 1x + 0,004 7 , R2 = 0,999 2 . La concentration massique de GSH dans l'échantillon a été calculée à partir de la courbe standard, puis la masse de GSH a été déterminée.
2.2 Taille moyenne des particules de GLip
La taille moyenne des grains de GLip était de (77,70 ± 0,5 mm). 70 ± 0 . 87) nm, PDI de (0. 219 ± 0 .005) et potentiel zêta de (- 27 .20 ± 0 .031) V. La distribution granulométrique de ces particules GLip de taille nanométrique est relativement uniforme et stable. 2.3 Effet de l'expérience à sens unique sur le taux d'incorporation des GLip
2.3 . 1 Effet de l'ajout de lécithine sur le taux d'enrobage
Selon le pré-test, le rapport de masse entre la lécithine et le cholestérol a été fixé à 4:1, la quantité de tween-80 était de 100 mg et la quantité de GSH était de 70 mg, et l'effet de l'ajout de 100, 150, 200, 250, 300 et 350 mg de lécithine sur le taux d'enrobage des GLip a été étudié. Comme le montre la figure 2, lorsque la quantité de lécithine ajoutée était inférieure à 200 g, le taux d'incorporation du GLip était proportionnel à la quantité de lécithine ajoutée, ce qui était principalement dû au fait que l'augmentation de la lécithine pouvait former davantage de bicouches phospholipidiques, qui pouvaient encapsuler davantage de GSH, augmentant ainsi le taux d'incorporation du GLip ; lorsque la quantité de lécithine ajoutée était de 200 g, le taux d'incorporation du GLip atteignait le taux le plus élevé, soit 63 % ; lorsque la quantité de lécithine ajoutée était supérieure à 200 g, le taux d'incorporation du GLip atteignait le taux le plus élevé, soit 63 %. Lorsque la quantité de lécithine ajoutée est supérieure à 200 g, le taux d'incorporation de GLip reste pratiquement inchangé, ce qui peut s'expliquer par le fait que la bicouche phospholipidique a une certaine limite pour incorporer le GSH et tend à être saturée après avoir atteint la quantité maximale de GSH incorporé. En outre, cet article adopte la méthode film-ultrasons pour préparer les GLip, si l'ajout de lécithine dans le système de préparation est trop élevé, cela entraînera la formation d'un film irrégulier après l'évaporation rotative, et il sera plus difficile de laver le film avec une solution PBS.
2.3.2 Effet du rapport lécithine/cholestérol sur le taux d'encapsulation
Le rapport de masse entre la lécithine et le cholestérol (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) a été fixé à 200 mg de lécithine, 100 mg de tween-80 et 70 mg de GSH, et l'effet du rapport entre la lécithine et le cholestérol (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) sur le taux d'enrobage des GLip a été étudié. Comme le montre la figure 3, avec l'augmentation du rapport lécithine/cholestérol, le taux d'incorporation des GLip augmente puis diminue, et lorsque le rapport lécithine/cholestérol est de 4:1, le taux d'incorporation des GLip atteint un maximum d'environ 55 %. Ceci est principalement dû au fait que le cholestérol est une sorte de lipide qui peut pénétrer dans la bicouche phospholipidique et renforcer l'étanchéité de la bicouche phospholipidique, ce qui rend le film stable et améliore le taux d'incorporation du Glip. Cependant, lorsque le rapport entre la lécithine ajoutée et le cholestérol était supérieur à 4:1, la bicouche phospholipidique devenait instable avec l'ajout de cholestérol, ce qui entraînait une augmentation de la perméabilité de la membrane, et même des difficultés dans la formation de la membrane, ce qui entraînait l'exsudation du GSH et diminuait le taux d'incorporation du GLip[16] .
2.3.3 Effet de l'ajout de Tween-80 sur le taux d'incorporation
Le rapport de masse de la lécithine et du cholestérol a été fixé à 4:1, l'ajout de lécithine était de 200 mg, l'ajout de GSH était de 70 mg, et l'effet de l'ajout de tween-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 mg) sur le taux d'enrobage des GLip a été étudié. Comme le montre la figure 4, le taux d'incorporation du GLip a atteint un maximum d'environ 60 % lorsque l'ajout de tween-80 était de 100 mg, en fonction de la tendance de l'ajout de tween-80. Le tween-80 est un agent de surface non ionique qui peut être distribué uniformément dans les phases aqueuse et lipidique des liposomes et encapsulé dans la bicouche lipidique, formant une membrane plus épaisse et rendant la structure de la bicouche phospholipidique plus stable. Par conséquent, lorsque la quantité de tween-80 était inférieure à 100 mg, le taux d'encapsulation des GLip augmentait avec l'augmentation du tween-80. L'effet de l'ajout de glutathion (30, 40, 50, 60, 70, 80 mg) sur le taux d'enrobage des GLip a été étudié. Comme le montre la figure 5, avec l'augmentation du GSH, le taux d'enrobage des GLip augmente puis diminue, et le taux d'enrobage des GLip atteint un maximum d'environ 60 % lorsque l'ajout de GSH est de 70 mg. Cela s'explique principalement par le fait que le glutathion est un médicament soluble dans l'eau.
La capacité à entrer dans la phase aqueuse à l'intérieur de la bicouche phospholipidique augmente le taux d'incorporation des liposomes de GSH. Cependant, le volume des vésicules de liposomes est limité et la quantité de glutathion incorporée est certaine[18] . Lorsque la quantité de glutathion ajoutée est supérieure à 70 mg, le volume de la phase aqueuse du liposome devient saturé et il est difficile de dissoudre davantage de glutathion, ce qui réduit le taux d'incorporation du GLIP.
2.3.5 Effet de la durée de l'ultrason sur le taux d'incorporation
Le rapport de masse entre la lécithine et le cholestérol a été fixé à 4:1, la quantité de lécithine ajoutée était de 200 mg, la quantité de tween-80 ajoutée était de 100 mg et la quantité de GSH ajoutée était de 70 mg, et l'effet du temps de sonication sur le taux d'enrobage des GLip a été étudié. Comme le montre la figure 6, avec l'augmentation du temps de sonication, le taux d'incorporation du GLip a montré une tendance à l'augmentation puis à la diminution. Lorsque le temps de sonication était de 10 minutes, le taux d'incorporation de GLip atteignait le maximum, soit environ 56 %. Dans le processus de préparation des liposomes, les ultrasons sont généralement utilisés pour redisperser les particules dans le système, de manière à obtenir des liposomes de petite taille et de distribution uniforme, afin d'augmenter la stabilité du système[19] . Cependant, lorsque la durée des ultrasons est trop longue, l'effet des ultrasons est renforcé, la structure du liposome est détruite et le GSH s'échappe, ce qui réduit le taux d'incorporation du GLip.
2.4 Optimisation des paramètres de préparation des GLip
2.4 . 1 Conception de Box-Behnken
Sur la base des résultats de l'expérience à sens unique, il est clair que la modification de l'ajout de lécithine
Le taux d'enrobage maximal de GLip en fonction de la quantité de lécithine, de GSH et de Tween-80 était plus élevé qu'en fonction du rapport lécithine/cholestérol et du temps d'exposition aux ultrasons, de sorte que les quantités de lécithine, de GSH et de Tween-80 ont été sélectionnées.
Les résultats de l'essai de surface d'impact à trois facteurs et trois niveaux ont été conçus selon le principe de la conception expérimentale combinée du centre de Box-Beknhen (CCTD), avec la quantité d'ajout et la quantité de Tween-80 comme variables indépendantes et le taux d'enrobage du GLip comme variable dépendante.
2.4.2 Construction de l'équation du modèle et test de signification
Les données du tableau 2 ont été analysées en utilisant le taux d'intégration de GLip comme valeur de réponse et ont été ajustées à une équation de régression polynomiale quadratique modélisée comme suit : Y = 63 . 92 + 3.20A + 3. 11B - 0.52C + 2.40AB - 0.75AC + 1 . 54BC - 3.74A2 - 2.28B2 - 1 .64C2 . Les résultats obtenus par le test de signification des coefficients de l'équation de régression sont présentés dans le tableau 3.
Le test de signification des coefficients de l'équation de régression et l'analyse de la variance (ANOVA) montrent que P < 0,000 1 , de sorte que le modèle de régression de la surface de réponse atteint un niveau hautement significatif ; et parce que R2 = 0,983 5 , cela montre que 98% des données peuvent être interprétées par l'équation du modèle, et la valeur P du terme hors ajustement est de 0,160 9 , ce qui est non significatif, ce qui signifie que le modèle choisi dans cette expérience est adapté à la préparation des GLip, et que le modèle de l'équation de régression quadratique est significatif. Cela indique que le modèle choisi dans cette expérience convient à la préparation des GLip et que le modèle de régression quadratique est significatif. Le taux d'incorporation des liposomes peut donc être obtenu et le processus de préparation des liposomes peut être optimisé. L'analyse de la variance (ANOVA) a montré que A, B, AB, BC, A2, B2 et C2 avaient un effet significatif sur le taux d'incorporation des GLip, et que les coefficients de régression standard des facteurs étaient A > B > C. Le coefficient de variation (CV) du modèle était CV = 1, et le coefficient de variation du modèle (CV) était CV = 1. Le coefficient de variation (CV) du modèle était de 1,40 %, ce qui indique que la différence entre les valeurs prédites et expérimentales était faible.
2.4 .3 Analyse des résultats de l'optimisation du processus de préparation
La méthodologie de la surface de réponse (RSM) est une représentation graphique d'un tracé de contour tridimensionnel dans un plan bidimensionnel d'une surface de réponse spécifique (Y) avec les facteurs correspondants A, B et C. Chaque surface de réponse est analysée pour deux des facteurs, et l'autre facteur est fixé au niveau zéro. Comme le graphique permet de visualiser l'effet des facteurs sur les valeurs de réponse, leurs interactions dans la préparation des GLip peuvent être trouvées sur les graphiques d'analyse de la surface de réponse obtenus à partir des expériences.20 L'effet des interactions des trois facteurs, l'ajout de lécithine, l'ajout de GSH et l'ajout de Tween-80, sur le taux d'enrobage des GLip est illustré dans les Fig. 7 et Fig. 9. - L'effet des trois facteurs sur le taux d'enrobage des GLip est illustré dans les Fig. 7 et Fig. 9.
Comme le montre la figure 7, la surface de réponse présente une pente plus raide, ce qui indique que l'interaction entre les ajouts de lécithine et de GSH a un effet plus important sur le taux d'enrobage des GLip. D'après les courbes de niveau de la figure 7, les ellipses sont plus denses dans la région où la lécithine a été ajoutée, ce qui indique que l'effet de l'ajout de lécithine sur le taux d'incorporation est plus important que celui de l'ajout de GSH. Lorsque la quantité de GSH était inchangée, le taux d'enrobage augmentait puis diminuait avec l'augmentation de la quantité de lécithine, et le taux d'enrobage atteignait son maximum lorsque la quantité de lécithine était comprise entre 225 et 250 mg. Lorsque la quantité de lécithine ajoutée était constante, avec l'augmentation du GSH, le taux d'enrobage augmentait d'abord, puis diminuait ; lorsque la quantité de GSH ajoutée était de 75-80 mg, le taux d'enrobage atteignait son maximum.
L'enveloppe du liposome est la lécithine, et le volume du liposome formé par une certaine quantité de lécithine est certain, et avec l'ajout de GSH, le volume du liposome sera surchargé. Comme le montre la figure 8, la pente la plus raide peut être observée sur le graphique de la surface de réponse, ce qui indique que l'interaction entre la quantité de lécithine ajoutée et la quantité de Tween-80 ajoutée a un effet plus évident sur le taux d'enrobage. Les courbes de niveau de la figure 8 montrent que les ellipses sont plus denses dans la région où l'on ajoute de la lécithine, ce qui indique que l'effet de l'ajout de lécithine sur le taux d'enrobage est plus important que celui de l'ajout de Tween-80 sur le taux d'enrobage. Lorsque la quantité de lécithine était constante, le taux d'incorporation augmentait avec l'augmentation de la quantité de tween-80, dont la mouillabilité augmentait d'abord et diminuait ensuite, facilitant la pénétration de l'eau et accélérant le taux de désintégration ; en outre, sa forte solubilisation et son anti-floculation augmentaient la dissolution du médicament, ce qui diminuait le taux d'incorporation. Lorsque la quantité de Tween-80 ajoutée était inchangée, avec l'augmentation de la quantité de lécithine, le taux d'incorporation était le premier à augmenter puis à diminuer, et le taux d'incorporation le plus élevé était atteint lorsque la quantité de lécithine ajoutée était de 225-250 mg.
2.4 .4 Validation des conditions optimales de préparation des GLip
Les paramètres optimaux pour la préparation des GLip ont été analysés à l'aide du logiciel statistique Design-Expert V8.0.6 : 232,84 mg de lécithine, 75,91 mg de GSH et 94,30 mg de thréonine-80, et le taux d'enrobage optimal prédit était de 66,27%. Afin de vérifier la validité du modèle, combiné à la situation expérimentale réelle, le processus de préparation optimal a été optimisé à 232 mg de lécithine, 75 mg de GSH, 94 mg de Tween-80, et le taux d'enrobage de GLip était de (65,85±0,54) % après 3 répétitions. La valeur absolue de l'erreur par rapport à la prédiction théorique était inférieure à 5 %. Cela indique que les paramètres du modèle optimisés par la méthodologie de la surface de réponse sont précis et que les conditions de préparation optimales sont fiables, ce qui est utile.
3 Conclusion
Dans le présent document, sur la base d'une expérience à sens unique utilisant le taux d'intégration comme indicateur, la méthode d'évaluation de l'efficacité de l'intégration a été utilisée.
La méthode de la surface de réponse a été utilisée pour analyser les interactions entre les facteurs affectant la préparation des GLip par la méthode du film mince-sonication, et les paramètres optimaux pour la préparation des GLip ont été obtenus, ce qui a amélioré le taux d'enrobage des GLip. Les conditions optimales de préparation étaient les suivantes : 232 mg de lécithine, 75 mg de GSH et 94 mg de tween-80, et le taux d'incorporation maximal de (65,85±0,54) % a été obtenu. Les résultats de cet article fournissent une référence pour le développement de systèmes de nanotransporteurs de GSH, ce qui peut promouvoir davantage l'application du GSH dans les domaines alimentaires et pharmaceutiques.
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