Le glutathion (GSH) est un tripeptide réactif formé par la condensation de l'acide glutamique, de la cystéine et de la glycine. Il est largement présent dans les cellules des plantes, des animaux et des micro-organismes et constitue le composé sulfhydryle non protéique le plus important ayant des fonctions physiologiques importantes. Il peut être utilisé comme coenzyme de certaines enzymes et a un effet activateur sur certaines enzymes sulfhydryles. Il est une sorte d'antioxydant qui protège les enzymes et les autres groupes sulfhydryles des protéines et joue un rôle important dans le transport des acides aminés, le maintien de l'intégrité de la membrane des globules rouges, la protection de l'hémoglobine et la libération des toxines, etc. Dans la pratique clinique, le glutathion est un médicament biochimique important pour le traitement des maladies du foie, des tumeurs, des empoisonnements, des cataractes, du vieillissement et des réactions allergiques. Ces dernières années, avec la découverte d'un plus grand nombre de fonctions physiologiques du glutathion, celui-ci a attiré beaucoup d'attention dans les additifs alimentaires, la médecine clinique et la nutrition sportive, et la demande de glutathion a augmenté.
Depuis que le glutathion a été extrait pour la première fois de la levure par Hopkin [2], il a fait l'objet d'études approfondies. Actuellement, l'extraction par solvant et la synthèse chimique sont les méthodes les plus abouties pour obtenir du glutathion de haute pureté. Toutefois, ces deux méthodes présentent des problèmes de lourdeur, de coût élevé et de pollution. Par conséquent, la méthode biologique, qui présente les avantages de conditions de réaction douces, d'un faible coût et d'étapes de réaction simples, sera la méthode la plus prometteuse pour la production de glutathion à l'avenir, et l'obtention de souches à haut rendement avec d'excellentes performances est la clé de la production de glutathion par cette méthode. À l'heure actuelle, il a été rapporté [3-5] que les souches capables d'accumuler davantage de glutathion sont principalement des levures et la plupart des bactéries Gram-négatives, et que les méthodes de sélection et de reproduction des souches utilisées sont principalement une combinaison de mutagenèse chimique traditionnelle (nitrosoguanidine, sulfate de diéthyle, méthanesulfonate d'éthyle, etc.) et de mutagenèse physique (lumière ultraviolette et rayons X), et que les souches mutantes obtenues sont principalement des souches résistantes au 1,2,4-triazole et à l'azoture de sodium, des souches résistantes à l'éthionine et des souches résistantes à l'éthionine, qui peuvent produire du glutathion par cette méthode. Les souches mutantes obtenues étaient principalement résistantes au 1,2,4-triazole et à l'azide de sodium, résistantes à l'éthionine, sensibles à la méthionine, résistantes au pyruvate et résistantes au disulfure de tétraméthyltoluène. Cependant, l'utilisation des rayons Y pour muter les souches productrices de glutathion et pour obtenir des souches à haut rendement marquées et résistantes au ZnCl n'a pas été signalée en Chine.
Les auteurs ont sélectionné une souche de Saccharomyces cerevisiae ayant une certaine capacité de production de glutathion parmi plus de 200 souches de levure collectées et conservées en laboratoire, et ont obtenu une bactérie produisant beaucoup de glutathion et résistante au chlorure de zinc et à l'éthylthionine par mutagénèse UV et rayons Y. Dans cet article, nous présentons le criblage et l'élevage de cette souche afin de jeter les bases d'une application industrielle.
1 Matériel et méthodes
1 . 1 Sources de souches
Saccharomyces cerevisiae (S . cerevisiae), collectées et conservées dans le laboratoire de microbiologie de l'université technologique de Zhejiang. 1 .2 Milieu et conditions de culture
1 .2 . 1 Milieu incliné (milieu complet) et conditions de culture :
Milieu de culture : pâte de levure 3g, moût 3g, peptone 5g, glucose 10g, agar 20g, volume à 1L d'eau, PH naturel, 1 × 105 pa Stérilisation 20min. Conditions de culture : 28℃, 1~2d.
1 .2 .2 Milieu de sélection des plaques et conditions de culture : milieu :
(1) Milieu de sélection Zncl2 : Milieu de base + 1,360 mg/L Zncl2, pH naturel, 1 × 105 pa Stérilisation pendant 20 min ; (2) Milieu de sélection Ethionine : Milieu de base + 1,360 mg/L Zncl2, pH naturel, 1 × 105 pa Stérilisation pendant 20 min ; (3) Milieu de base : Milieu de base
Conditions de culture : 28℃, incubation 5-7d. Conditions de culture : 28℃, 5-7d.
1 .2 .3 Milieu de culture et conditions de culture :
Milieu : glucose 18g, saccharose 12g, peptone 30g, pâte de levure 1g, NH4 H2 pO4 0 . 55g, (NH4)2 SO4 12g, MgSO4 -6H2 O 2g , FeSO4 -7H2 O 0 . 1g, inositol 75mg, biotine 24μg, vitamine B1 0 . 8mg, 10g de moût de malt, et fixé à 1L d'eau, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0,70 × 105 pa, stérilisé pendant 30 minutes. Conditions de culture : bouteille triangulaire de 250mL avec 30mL de milieu, 28℃, incubation pendant 2~3d, vitesse d'agitation 200r/min.
1 .2 .4 Milieu de fermentation et conditions de culture :
Milieu : milieu de semences + 200mg/L de chlorhydrate de L-cystéine, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0 . 7 × 105 pa Stérilisation pendant 30 minutes. Conditions de culture : flacon triangulaire de 250mL contenant 30mL de milieu, volume d'inoculum de 10%, 28℃, incubation pendant 3d, vitesse d'agitation de 200r/min.
1 .3 Principaux instruments
Stérilisateur à vapeur à pression verticale LS-B50L, Shanghai Medical Nuclear Instrument Factory ; Spectrophotomètre 751-GW, Shanghai Analytical Instrument Factory ; Centrifugeuse de table à haute vitesse Labofuge 400R, fabriquée en Allemagne.
1 .4 Traitement mutagène
1 .4 . 1 Traitement aux UV :
Prendre la lamelle fraîche cultivée pendant 1~2 jours, laver le corps bactérien avec une solution saline stérile pour obtenir une suspension bactérienne, et obtenir une suspension unicellulaire après oscillation des billes de verre et filtration par de la laine de coton écrémée, ajuster le nombre de bactéries de la suspension à environ 108/mL, aspirer 3mL de suspension bactérienne dans une petite boîte de Pétri stérile, puis sous l'irradiation d'une lampe ultraviolette de 15W (à une distance de 30cm), agiter avec une force magnétique.
30s, la suspension bactérienne a été convenablement diluée et appliquée sur la plaque sous la lumière rouge dans la salle stérile, et la plaque a été inversée et incubée dans l'incubateur à température constante de 28℃ pendant 5 jours.
7d.
1.4.2 Irradiation aux rayons Y 60co : des éprouvettes fraîchement cultivées ont été utilisées pour l'irradiation directe. L'irradiation a été effectuée avec 0,5KGY, 2,5KGY, 2,5KGY et 2,5KGY respectivement. 5KGY, 2.0KGY et 0.5KGY respectivement. 0,5KGY, 2,0KGY dose de 60coY irradiation des bactéries dans les tubes à essai, avec une solution saline stérile sera irradié par le carré oblique dans le nombre de données bactériennes suspension, et après une dilution appropriée enduit avec la plaque, la plaque a été inversée dans 28 ℃ thermostat incubation pendant 5 ~ 7 d. La plaque a ensuite été placée dans une boîte à température constante.
1 .5 Procédure de mutagenèse des souches
Souche de départ → irradiation UV → isolement naturel → irradiation aux rayons Y 60cO → bactéries productrices de glutathion. 1 .6 Méthodes d'analyse
1 .6 . 1 Mesure de la teneur en glutathion intracellulaire :
Méthode de dérivatisation du réactif ALLOXAN, voir la littérature [6].
1 .6 .2 Détermination de la biomasse :
Les organismes ont été lavés deux fois avec de l'eau distillée, le surnageant a été éliminé et les organismes humides ont été séchés à 105°C jusqu'à ce qu'ils atteignent un poids constant, puis pesés.
2 Résultats
2 . 1 Détermination de la souche de départ mutagène
Après un criblage primaire et secondaire dans des flacons à agitation de plus de 200 souches de levure collectées et conservées dans notre laboratoire, la levure de bière n° 346 présentait le rendement et la teneur en glutathion les plus élevés, avec 36,88 mg/L de glutathion par gramme de cellules sèches. Son rendement en glutathion était de 36,88 mg/L et sa teneur en glutathion par gramme de cellules souches était de 4,72 mg. Son rendement en glutathion était de 36,88 mg/L et sa teneur en glutathion de 4,72 mg par gramme de cellules sèches. Il a été décidé d'utiliser la souche 346 comme souche de départ pour la sélection des mutations.
2 .2 Sélection de la concentration de zncl2 dans les plaques de criblage
Le zn2+ est un cofacteur de diverses déshydrogénases, décarboxylases et peptidases [7], et c'est un oligo-élément nécessaire à la croissance des levures. La concentration de zncl2 et la létalité sont représentées dans la figure 1, qui montre qu'il existe une relation dose-effet claire entre la concentration de zncl2 dans le milieu et la létalité des souches expérimentales ; avec l'augmentation de la concentration de zncl2, le taux de létalité augmente progressivement. Lorsque la concentration de zncl2 est de 680 mg/L, la létalité est de 80 %, et la létalité est de 100 % lorsque la concentration de zncl2 est supérieure à 2 040 mg/L. Dans cet article, la létalité de 93,5 % de la concentration de zncl2 a été sélectionnée. Dans cet article, le taux de létalité de 93,5 % a été choisi comme dose de concentration de zncl2 de 1 360 mg/L pour la plaque sélective.
2 .3 Traitement mutagène par ultraviolets
La souche 346 a été traitée par mutation aux ultraviolets, et la suspension de la souche mutée a été étalée sur du milieu complet et du milieu de sélection zncl2, et les colonies simples à croissance rapide avec de grandes colonies ont été sélectionnées à partir des plaques pour être inoculées avec la boue après incubation, et les souches mutantes et les souches de départ ont été inoculées dans le milieu de semences et le milieu de fermentation respectivement, et la biomasse et le rendement en glutathion ont été déterminés à la fin de la fermentation, les résultats sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
Le tableau 1 montre que la teneur moyenne en glutathion et le rendement des souches mutantes résistantes aux UV et zncl2 étaient plus élevés que ceux de la souche en développement et de la souche mutante résistante aux UV, et que le taux positif était également plus élevé que celui de la souche mutante résistante aux UV, ce qui prouve que l'effet de criblage de l'utilisation de zncl2 comme agent de criblage pour les souches mutantes à haut rendement était nettement meilleur que celui du criblage aléatoire traditionnel. Le tableau 2 montre que : (1) les souches mutantes uvzn10-3 résistantes aux UV et zncl2 ont montré la teneur en glutathion et le rendement les plus élevés, avec 11,38 mg de glutathion par gramme de cellules souches, ce qui est supérieur à la souche sortante. La teneur en glutathion par gramme de cellules souches a atteint 11,38 mg, soit 141,1 % de plus que la souche sortante. La teneur en glutathion par gramme de cellules souches était de 11,38 mg, soit 141,1 % de plus que celle de la souche de départ. Le rendement en glutathion était de 92,2mg/L, soit 150% de plus que la souche de départ.(2) Le glutathion est un produit intracellulaire, et une certaine quantité de biomasse est la condition préalable à un rendement élevé. La souche uvzn10-3 a produit 92,2mg/L de glutathion, et sa biomasse était de 92,2mg/L, ce qui était le rendement le plus élevé en glutathion. La souche uvzn10-3 a produit 2mg/L de glutathion, et sa biomasse n'était que de 8 . La biomasse de l'uvzn10-5 était de 8,2 g/L, tandis que la biomasse de l'uvzn10-5 était de 11,9 g/L. La biomasse de la souche uvzn10-5 était de 11,9 g/L, mais le rendement en glutathion n'était que de 35,96 mg/L. La biomasse de la souche uvzn10-5 était de 11,9 g/L, mais le rendement en glutathion n'était que de 35,96 mg/L, ce qui montre que la biomasse n'est pas proportionnelle au rendement. Par conséquent, les souches mutantes à forte teneur en glutathion devraient être sélectionnées lors de la sélection des souches, et la biomasse devrait être augmentée en optimisant les conditions de culture, afin d'améliorer le rendement.
Afin d'éviter l'impureté de la souche causée par le phénomène de retard phénotypique, la souche mutante uvzn10-3 résistante au zncl2 a été isolée naturellement, et une augmentation de 41,83 % de la production de glutathion a été obtenue par rapport à la souche uvzn10-3. La souche purifiée H8 a permis d'obtenir un rendement en glutathion supérieur de 83 % à celui de la souche uvzn10-3.
2 . 4 60 Traitement de mutagenèse par rayons COY
H8 a été utilisée comme souche de départ après une dose de 2 . H8 a été utilisée comme souche de départ. Après irradiation avec un rayonnement de 60 coY à des doses de 2,0KGY et 0,5KGY, la suspension bactérienne mutagénisée a été étalée sur un milieu complet, un milieu de sélection au chlorure de zinc et un milieu de sélection à l'éthionine, et 20 colonies uniques à croissance rapide et de grande taille ont été sélectionnées pour inoculer la suspension, puis la biomasse et la production de glutathion ont été déterminées après la fermentation secondaire dans des flacons à agitation, et les résultats ont été présentés dans la figure 2.
Comme le montre la figure 2, la dose d'irradiation de 0,5KGY était plus élevée que celle de 2,5KGY. La dose de 5KGY était meilleure que celle de 2,0KGY. 0KGY, ce qui est cohérent avec le point de vue selon lequel une faible dose est favorable à la sélection de souches mutantes positives, comme indiqué dans de nombreuses publications. Dans les six groupes d'expériences, la dose d'irradiation de 0,5KGY était meilleure que celle de 2,0KGY. Parmi les six groupes d'expériences, les souches irradiées avec 0,5KGYY et enrobées sur des plaques d'éthionine ont montré les meilleurs résultats, non seulement l'amplitude de la mutation positive était grande, mais aussi l'amplitude de la mutation positive était élevée. Cela s'explique par le fait que l'éthionine est un analogue métabolique du glutathion et que la souche mutante résistante à l'éthionine peut effectivement libérer la régulation en retour de la bactérie elle-même, de sorte que ce mode de criblage est propice à la sélection de souches mutantes positives. Parmi les mutants irradiés aux rayons Y, le mutant 0.5Eth400-5 résistant à l'éthionine présente les caractéristiques suivantes. Parmi les souches mutantes irradiées aux rayons Y, le mutant 0.5Eth400-5 résistant à l'éthionine était le meilleur, avec un rendement en glutathion de 165,96 mg/L, supérieur à celui du mutant original. Le rendement en glutathion de cette souche était de 165,96 mg/L, soit 350 % de plus que celui de la souche originale, et la teneur en glutathion par gramme de cellules souches était de 19,76 mg, ce qui était plus élevé que celui de la souche originale. Le rendement en glutathion de cette souche était de 165,96 mg/L, soit 350 % plus élevé que celui de la souche originale. Le rendement en glutathion de cette souche était de 165,96 mg/L, soit 350 % de plus que la souche originale.
2 . 5 Examen de la stabilité des souches mutantes
La stabilité du gène à haut rendement de B. glutamicum a été étudiée par les méthodes de population successive et de transmission périodique en cryoconservation. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Les résultats montrent que la souche 0.5Eth400-5 a été transmise sur la lamelle pendant 10 générations consécutives. La souche 0.5Eth400-5 a été transmise sur la lamelle pendant 10 générations consécutives, et la production de glutathion a diminué de 10,7 %. 7%. En même temps, la souche a été stockée dans un réfrigérateur 4℃ à basse température, et la production de glutathion n'a diminué que de 6% en 4 générations, ce qui indique que la souche mutante a une bonne stabilité, mais qu'il est nécessaire de renforcer la souche périodiquement.
3 Discussion
3 . 1 Criblage de mutants résistants au chlorure de zinc
Au niveau intracellulaire, le glutathion est oxydé en glutathion oxydé (GSSG) par la glutathion peroxydase (GSH-PX) en raison de son implication dans les antioxydants internes (par exemple, le piégeage du H2 02 produit métaboliquement par les érythrocytes), et le GSSG est converti en glutathion réduit actif par la glutathion réductase. Dans la réaction (2), la glutathion réductase est une enzyme régulatrice et est inhibée par le zn2+ intracellulaire. À partir d'une certaine quantité, le centre actif de la glutathion réductase est déformé et inactivé, ce qui arrête la production de GSH [9]. Lorsque le zn2+ intracellulaire atteint un niveau tel que les cellules bactériennes ne peuvent plus décomposer les oxydes forts toxiques, elles meurent. La souche mutante uvzn10-3 résistante au chlorure de zinc a pu se développer sur des plaques de znCl2 à forte teneur en znCl2, ce qui a permis d'atténuer l'inhibition de la glutathion réductase par le zn2+. Par conséquent, l'ajout de znCl2 au milieu de culture peut favoriser la croissance de la levure et augmenter la biomasse sans inhiber la réduction du GSSG, augmentant ainsi la production de glutathion.
3 .2 Criblage de souches mutantes résistantes à l'éthionine
La biosynthèse du glutathion est directement contrôlée par la synthase selon le mécanisme suivant :
Acide L-glutamique + L-cystéine glutamylcystéine (1)
Y-Glutamylcystéine + Glycine Glutathion (2) La réaction (1) est l'étape de contrôle de la biosynthèse du glutathion, qui est catalysée par la Y-glutamylcystéine synthétase (GSH-I), une enzyme régulatrice soumise à une inhibition en retour par le glutathion, le produit final. Lorsqu'une certaine quantité de glutathion s'accumule au niveau intracellulaire, le glutathion se lie au site régulateur de la molécule enzymatique et inactive le centre actif de l'enzyme, inhibant ainsi la synthèse ultérieure du glutathion [4]. L'éthionine est un analogue métabolique du glutathion, qui se lie également au site régulateur du GSH-I. Comme l'éthionine ne participe pas à la synthèse des protéines, sa concentration dans la cellule ne diminuera pas, de sorte qu'il est difficile de restaurer l'activité enzymatique du GSH-I après la liaison, et la bactérie ne peut pas continuer à synthétiser le GSH, et elle mourra en raison de l'accumulation de substances toxiques excessives dans la cellule.
En utilisant un mutant résistant au chlorure de zinc comme souche de départ, une souche mutante résistante à l'acide éthionique, analogue du métabolisme du glutathion, a été criblée par 60COY. Cette souche pouvait effectivement supprimer l'inhibition en retour du GSH-I par le glutathion, et donc augmenter la teneur en glutathion de la bactérie.
3 .3 Conclusion
Une souche mutante 0.5Eth400-5 résistante au chlorure de zinc et à l'éthionine a été obtenue par sélection par inférence en utilisant des données de lignes extra-carrées et des radiations 60COY pour mutagéniser la souche de départ. La souche 5Eth400-5 a été fermentée dans des flacons à agitation et a produit 165,96 mg/L de glutathion. La fermentation de cette souche a donné un rendement en glutathion de 165,96 mg/L, avec 19,26 mg de glutathion par gramme de cellules souches. 19,26 mg de glutathion par gramme de cellules souches. Cette expérience a démontré que l'utilisation de bactéries résistantes au ZnCl et à l'éthionine comme modèle de criblage peut être utilisée pour sélectionner et élever des bactéries produisant beaucoup de glutathion.
Références :
[1] Zheng Yunlang . Biological Bulletin, 1995, 30(5) : 22 ~ 24 . [2] Hopkins F G. J Biochem, 1921, 15 : 286 ~ 305 .
[3] Murata K, Kimura A. Biotechnol Adv, 1990, 8(1) : 59 ~ 96 .
[4] Zhan Gu-Yu, Tian Ping, Liu We-Dong, et al. Journal of Pharmacy, 1990, 25(7) : 494 ~ 499 . [5] Kimura A, Murata K. United States patent 4, 598, 046, 1986-07-01 .
[6] Shen Beiying, Jiang Zhiwei. Grain and oil, 1993, 2 : 27 ~ 32 .
[7] Zhou Deqing . Tutoriel de microbiologie . Beijing : Higher Education Press, 1993 . 104 ~ 105 .
［8］Food Chan Sze-foon, Siu Hee-pui. Biochimie de la levure . Jinan : Shandong Science and Technology Press, 1990 . 61 .
[9] walther U I, wilhelm B, walther S. In vitro Mol Toxicol, 2000, 13(2) : 145 ~ 151 .
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