Effets de différentes concentrations de glutathion sur le stress oxydatif dans les érythrocytes stockés

 Résumé : Objectif Étudier les effets de différentes concentrations de glutathion (GSH) sur le stress oxydatif dans les globules rouges stockés (sRBC). Méthodes 6 sRBCs fraîchement préparés ont été divisés en 4 groupes : ACD, GSH1, GSH2 et GSH3, chaque groupe a été divisé en 3 ml. 1 ml de solution de conservation ACD-B a été ajouté au groupe ACD et 50 μl de solution saline ont été ajoutés au groupe ACD. 1 ml de solution de conservation ACD-B a été ajouté aux groupes GSH1, GSH2 et GSH3 et 12,5, 62,5, 12,5 et 12,5 μl de GSH ont été ajoutés aux groupes GSH1, GSH2 et GSH3, respectivement. Les groupes GSH1, GSH2 et GSH3 ont été additionnés de 1 ml de solution de conservation ACD-B et de 50 μl de solution de GSH de 12,5, 62,5 et 125 μmol/L, respectivement. Les quatre groupes ont été conservés au réfrigérateur à 4 ℃. Les 1er, 7e, 14e et 21e jours de conservation, la teneur en ATP et l'activité enzymatique GSH-PX dans les sRBC ont été déterminées par dosage immuno-enzymatique (ELISA), l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans les sRBC a été mesurée par dosage de la xanthine oxydase, et la teneur en malondialdéhyde (MDA) dans les sRBC a été mesurée par le dosage colorimétrique de l'acide thiobarbiturique, respectivement.

 

Par rapport au groupe ACD, la teneur en ATP et l'activité enzymatique GSH-PX étaient significativement plus élevées dans les groupes GSH2 et GSH3 aux jours 1, 7, 14 et 21 (P<0,05), et la teneur en ATP et l'activité enzymatique GSH-PX étaient significativement plus élevées dans les groupes GSH2 et GSH3 par rapport au groupe GSH1 (P<0,05). Par rapport au groupe ACD, l'activité enzymatique de la SOD était significativement plus élevée dans le groupe GSH2 aux jours 1, 7, 14 et 21 (P<0,05), et dans le groupe GSH3 aux jours 1, 7 et 14 (P<0,05) ; et par rapport au groupe GSH1, l'activité enzymatique de la SOD dans les groupes GSH2 et GSH3 était significativement plus élevée au jour 21 (P<0,05). Par rapport au groupe ACD, la teneur en MDA dans les groupes GSH2 et GSH3 était significativement plus faible aux jours 1, 7, 14 et 21 (P<0,05) ; par rapport au groupe GSH1, la teneur en MDA dans les groupes GSH2 et GSH3 était significativement plus faible aux jours 1, 7 et 21 (P<0,05). Il a été conclu que l'ajout de 62,5 et 125 μmol/L de glutathion aux sRBCs avait un certain effet de stress anti-oxydatif et pouvait réduire les dommages de stockage des sRBCs.

 

Les globules rouges stockés (sRBC) subissent des dommages progressifs au cours du processus de stockage, en fonction de la durée de celui-ci. Les changements dans les dommages de stockage ne concernent pas seulement le niveau métabolique, mais aussi l'homéostasie redox et les changements cytosquelettiques[1-2] . Dans le cadre de l'étude de l'atténuation des dommages liés au stockage, notre équipe de recherche a mené des recherches plus approfondies sur l'augmentation de l'apport énergétique[3-4] . Le glutathion réduit (GSH) peut être l'un des mécanismes importants conduisant aux dommages de stockage des GRVs[5] . Le GSH peut réduire le stress oxydatif des GRVs et réduire les dommages des GRVs. Dans cette expérience, nous avons ajouté différentes concentrations de GSH aux sRBC et observé les changements des indices liés aux sRBC après différents temps de stockage afin d'étudier l'effet de stress anti-oxydatif du GSH dans le processus de stockage des sRBC.

 

Matériels et méthodes

cellule expérimentale    

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital (KLLY-2019-028). Le service de transfusion sanguine a fourni 6 portions (200 ml chacune) d'érythrocytes délétères frais, de la préparation à l'application clinique, et 12 ml de chaque portion ont été prélevés, et la portion restante a été conservée pour une utilisation future.

Groupement et traitement 12 ml de sRBCs ont été répartis en quatre groupes : groupe acide-citrate-dextrose (ACD), groupe GSH1, groupe GSH2 et groupe GSH3, 3 ml dans chaque groupe, sur la table d'opération aseptique. Dans cette expérience, le gradient de concentration de la solution de GSH était de 12,5, 62,5 et 125 μmol/L, respectivement, selon la méthode de la littérature [6]. 1 ml de solution de conservation ACD-B a été ajouté au groupe ACD, suivi de 50 μl de sérum physiologique, et 1 ml de solution de conservation ACD-B a été ajouté aux sRBCs des groupes GSH1, GSH2 et GSH3, et les solutions de GSH de 12,5, 62,5 et 125 μmol/L ont été ajoutées aux sRBCs des groupes GSH1, GSH2 et GSH3, respectivement. Une solution de GSH à des concentrations de 12,5, 62,5 et 125 μmol/L a été ajoutée aux sRBCs des groupes GSH1, GSH2 et GSH3, puis 50 μl de solution de GSH leur ont été ajoutés. Les sRBCs des quatre groupes ont été conservés au réfrigérateur à 4 ℃.

 

Méthode ELISA : 100 μl de sRBC ont été placés dans un tube à centrifuger stérile les 1er, 7e, 14e et 21e jours de stockage, et le surnageant a été centrifugé à 10 000×g pendant 10 min à 4 ℃. La teneur en adénosine triphosphate (ATP) des sRBC a été détectée conformément au manuel d'instructions du kit de réactifs (n° de lot : BC0305). La teneur en adénosine triphosphate (ATP) des sRBC a été mesurée conformément aux instructions du kit (BC0305). Les 1er, 7e, 14e et 21e jours de stockage, 20 μl de sRBC ont été prélevés et dilués avec 1 ml d'eau distillée pour obtenir une solution d'hémolysat 1:49. La solution a été légèrement agitée et bien mélangée, puis laissée au repos pendant 5 min jusqu'à ce que la solution soit complètement transparente à la lumière. L'activité de la glutathion peroxydase (GSH-PX) du GRAS a été détectée conformément aux instructions du kit (numéro de lot : A005-1). Tous les échantillons ont été décongelés une fois et chaque échantillon a été mesuré 4 fois et la valeur moyenne a été retenue.

 

Test de la xanthine oxydase : 50 μl de sRBC ont été prélevés les 1er, 7ème, 14ème et 21ème jours de stockage, 1 ml de solution saline a été ajouté, centrifugé à 500~1000×g pendant 10 min, et le surnageant a été aspiré par micropipette pour laisser le sRBC précipité. Prendre le sRBC précipité après centrifugation et ajouter 4 fois le volume de sRBC à l'eau distillée (200 μl), et mélanger dans un mélangeur vortex pendant 1 min pour lyser complètement les cellules. Ajouter 0,1 ml d'éthanol anhydre au lysat de sRBC et mélanger soigneusement sur un mélangeur à vortex pendant 30 s, puis ajouter 0,1 ml de trichlorométhane et mélanger sur un mélangeur à vortex pendant 1 min, et centrifuger les cellules à 3 500×g pendant 8 min. À ce moment, le liquide a été divisé en trois couches, et la couche supérieure était la solution d'extraction de la superoxyde dismutase (SOD) utilisée pour l'essai. Le dosage a été effectué conformément aux instructions du kit (lot n° A001-1). Les mesures ont été répétées 4 fois pour chaque échantillon et la valeur moyenne a été retenue.

 

Test colorimétrique à l'acide thiobarbiturique : 150 μl de sRBC ont été prélevés les 1er, 7ème, 14ème et 21ème jours de stockage, 2-3 ml de solution saline ont été ajoutés, centrifugés à 3000×g pendant 10 min, et le surnageant a été aspiré à l'aide d'une micropipette afin d'éliminer les sRBC précipités. Prendre le sRBC précipité après centrifugation et ajouter 4 fois le volume de sRBC à l'eau distillée (600 μl), et mélanger pendant 1 min sur un mélangeur vortex pour lyser complètement les cellules. Ajouter 0,3 ml d'éthanol anhydre au lysat sRBC et mélanger soigneusement pendant 30 s sur un mélangeur à vortex, puis ajouter 0,3 ml de trichlorométhane et mélanger pendant 1 min sur un mélangeur à vortex, et centrifuger à 3 500×g pendant 10 min. À ce stade, le liquide a été divisé en trois couches, et la couche supérieure était l'extrait de malondialdéhyde (MDA) pour la détection. L'essai a été réalisé conformément aux instructions du kit (lot n° A003-1). Les mesures ont été répétées 4 fois pour chaque échantillon et la moyenne a été calculée.

 

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS 18.0 et les graphiques ont été tracés à l'aide du logiciel Graphpad Prism 8.0. Les mesures normalement distribuées ont été exprimées en moyenne±écart-type (±s), et les comparaisons entre les groupes ont été effectuées par analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs et à mesures répétées. p<0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

 

Résultats

Teneur en ATP La teneur en ATP des groupes GSH2 et GSH3 aux jours 1, 7, 14 et 21 était significativement plus élevée (P<0,05) que celle du groupe ACD. Par rapport au groupe GSH1, les niveaux d'ATP dans les groupes GSH2 et GSH3 étaient significativement plus élevés (P<0,05) (Tableau 1).

Activité GSH-PX L'activité GSH-PX était significativement plus élevée dans les groupes GSH2 et GSH3 aux jours 1, 7, 14 et 21 par rapport au groupe ACD (P<0,05). L'activité GSH-PX était significativement plus élevée dans les groupes GSH2 et GSH3 par rapport au groupe GSH1 (P<0,05) (Tableau 2).

L'activité de la SOD était significativement plus élevée dans le groupe GSH2 aux jours 1, 7, 14 et 21 par rapport au groupe ACD (P < 0,05), et dans le groupe GSH3 aux jours 1, 7 et 14 (P < 0,05). L'activité de la SOD était significativement plus élevée dans les groupes GSH2 et GSH3 au 21e jour (P < 0,05) que dans le groupe GSH1 (tableau 3).

Teneur en MDA La teneur en MDA dans les groupes GSH2 et GSH3 était significativement plus faible (P<0,05) que dans le groupe ACD aux jours 1, 7, 14 et 21 (tableau 4). Par rapport au groupe GSH1, les niveaux de MDA dans les groupes GSH2 et GSH3 étaient significativement inférieurs (P<0,05) aux jours 1, 7 et 21 (Tableau 4).

 

discussion

Le sRBC est le produit sanguin le plus utilisé en clinique, et la qualité du sRBC est étroitement liée à diverses complications transfusionnelles[7-8] . La qualité de la solution de conservation du sRBC a été améliorée, et le rôle de la solution de conservation du sRBC ACD, couramment utilisée en clinique à l'heure actuelle, est principalement de maintenir la structure et la fonction du sRBC, mais elle ne peut toujours pas éviter les troubles métaboliques, le stress oxydatif et d'autres réactions du sRBC qui conduisent à des dommages de conservation du sRBC pendant la conservation. Cependant, il ne peut pas empêcher les troubles métaboliques, le stress oxydatif et d'autres réactions pendant le stockage des GRVs qui conduisent à des dommages de stockage des GRVs. Le stress oxydatif est une cause importante des lésions de stockage des érythrocytes[9-10] . Dans les érythrocytes sains, les dommages oxydatifs peuvent être atténués dans une certaine mesure par le système antioxydant, qui comprend des composés antioxydants tels que le GSH, la vitamine E, la vitamine C et des enzymes (GSH-PX, catalase et SOD)[11] . Parmi eux, le GSH réduit est l'antioxydant naturel le plus abondant présent dans les cellules humaines[11-12] .

 

Le GSH est un tripeptide (γ-glutamyl-L-cystéine-glycylglycine) qui se présente sous deux formes dans l'organisme : le GSH réduit et le GSSG oxydé, le GSH réduit représentant la majorité dans les conditions physiologiques. Le GSH réduit peut se combiner directement avec des oxydants tels que le peroxyde d'hydrogène pour produire de l'eau et du GSSG oxydé. Il peut également réduire la méthémoglobine en hémoglobine pour maintenir la stabilité des membranes érythrocytaires, et les érythrocytes ayant une teneur plus élevée en GSH subiront moins de dommages dus au stress oxydatif pendant le stockage. Plus la teneur en GSH est élevée, moins les érythrocytes sont endommagés par le stress oxydatif pendant le stockage. Par conséquent, l'ajout de GSH à la solution de stockage ACD des sRBC peut contribuer à réduire les dommages causés par le stockage des sRBC. Dans cette expérience, la concentration et le volume du liquide ACD étaient strictement conformes aux normes de conservation des sRBC dans les banques de sang, et la préparation de la solution de GSH était basée sur la méthode de la littérature [6], dans laquelle les gradients de concentration de 12,5, 62,5 et 125 μmol/L de solution de GSH ont été configurés respectivement.

 

Les dommages typiques du stockage des sRBC sont une diminution du niveau d'ATP intracellulaire, une diminution du GSH et une augmentation du GSSG[13]. L'ATP est le fournisseur d'énergie intracellulaire, et une diminution de son contenu affectera sérieusement l'activité et la fonction normales des érythrocytes[14], et les résultats des dommages du stockage des sRBC par l'ajout de différentes concentrations de GSH ont montré que le contenu en ATP était plus élevé lorsque le GSH était ajouté aux sRBC avec des concentrations de 62,5 et 125 μmol/L que celui de 12,5 μmol/L GSH, ce qui suggère que l'ajout de 62,5 et 125 μmol/L GSH dans la solution de stockage de l'ACD-B a augmenté le contenu en ATP. Les résultats ont montré que dans le même temps, l'ajout de GSH à des concentrations de 62,5 et 125 μmol/L a entraîné une teneur en ATP plus élevée que celle de 12,5 μmol/L. Cela suggère que l'ajout de 62,5 et 125 μmol/L de GSH à la solution de stockage ACD-B peut ralentir la tendance à la baisse de l'ATP, augmenter la capacité antioxydante des sRBC, atténuer le stress oxydatif des cellules et réduire les dommages liés au stockage des érythrocytes.

Le GSH-PX est l'un des antioxydants les plus importants de l'organisme, qui peut bloquer les dommages supplémentaires causés par les radicaux réactifs de l'oxygène, agir comme la sélénocystéine et décomposer les peroxydes lipidiques dans l'organisme en utilisant le GSH comme réducteur pour empêcher les membranes cellulaires et d'autres tissus biologiques d'être endommagés par la peroxydation[15] . Les résultats de la présente étude ont montré que les activités GSH-PX et SOD étaient plus élevées dans les sRBC ayant des concentrations de GSH de 62,5 et 125 μmol/L que dans ceux ayant une concentration de GSH de 12,5 μmol/L au même moment. En même temps, les activités GSH-PX et SOD étaient plus élevées dans les sRBCs que dans les sRBCs avec 12,5 μmol/L de GSH. Lorsque le GSH à des concentrations de 62,5 μmol/L et 125 μmol/L a été ajouté à la solution de stockage ACD-B, les indicateurs de l'ATP, GSH-PX, SOD et MDA ont été significativement améliorés, ce qui suggère que l'ajout d'une certaine concentration de GSH à la solution de stockage ACD-B peut atténuer les dommages peroxydatifs de la membrane cellulaire, et confirme en outre que le GSH joue un rôle antioxydant dans la préservation des érythrocytes.

 

Dans le corps humain, les radicaux libres agissent sur les lipides pour produire une réaction de peroxydation, et le produit final de l'oxydation est le MDA. En ajoutant différentes concentrations de GSH aux sRBC, les résultats ont montré qu'en même temps, la teneur en MDA du GSH ajouté à 62,5 et 125 μmol/L était inférieure à celle ajoutée à 12,5 μmol/L. Cela suggère que l'ajout de GSH à 62,5 et 125 μmol/L à l'agent de conservation ACD-B peut ralentir la tendance à la hausse du MDA et améliorer la capacité des sRBC à piégeage des radicaux libres. Il est suggéré que l'ajout de GSH à des concentrations de 62,5 et 125 μmol/L à la solution de conservation ACD-B peut ralentir l'augmentation de la MDA et améliorer la capacité de piégeage des radicaux des sRBC.

 

Les résultats de cette étude expérimentale ont montré que l'ajout de certaines concentrations de GSH (62,5, 125 μmol/L) à la solution de conservation de l'ACD-B pouvait réduire les dommages de stockage des sRBCs. Cependant, cette étude expérimentale n'a comparé que les effets de trois concentrations de GSH sur les sRBCs, et la concentration optimale de GSH pour la conservation des sRBCs doit faire l'objet d'une étude plus approfondie. En outre, les effets du GSH sur la morphologie et la fonction des GRVs n'ont pas été observés dans cette étude expérimentale et doivent être étudiés de manière plus approfondie.

 

En conclusion, pendant la période de conservation des GRVs conservés dans la solution de conservation ACD-B, la teneur en ATP, les activités enzymatiques GSH-PX et SOD des GRVs ont diminué et le niveau de MDA a augmenté progressivement avec l'augmentation graduelle du temps. L'ajout de concentrations appropriées d'antioxydants à la solution de conservation des GRVS peut améliorer la qualité de la conservation des érythrocytes et réduire les dommages causés par le stockage des GRVS.

 

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